改良的抗体文库制造技术

本发明专利技术的特征在于改良的体外ＲＮＡ展示文库，以允许从表达文库中可靠表达和选择ｓｃＦｖ抗体分子。本发明专利技术的ｓｃＦｖ抗体文库包含最优化的、缩短的结构域间接头，其改善表达ｓｃＦｖ抗体表达。ｓｃＦｖ抗体文库还包括短核酸条形码，其允许鉴定个别文库克隆、文库或其亚群。还提供了用于生成、扩增且对本发明专利技术的ｓｃＦｖ抗体文库进行谱型分析的引物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改良的抗体文库以及用于制备其的方法和材料。
技术介绍
以高特异性和亲和力与几乎任何结构表位结合的抗体常规用作研究工具和FDA批准的治疗剂。因此，治疗用和诊断用单克隆抗体构成全世界数十亿美元的市场。使动物免疫接种以获得抗体的传统方法是缓慢且麻烦的。因此，已开发了使用合成抗体文库用于先体外后体内选择针对所需靶分子的抗体的几种方法。在一些方法中，抗体或其片段的文库展示在生物(例如，酵母细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞)或亚显微因子 (例如，噬菌体或病毒)的表面上，并且就所需抗体的表达选择生物或亚显微因子。在其他方法中，在无细胞体外系统中表达且选择抗体文库。目前的体外表达系统尽管善于表达单个抗体可变结构域，但在表达多结构域抗体例如单链抗体(scFv)分子方面无效。这是由于目前的scFv抗体文库的结构和目前的体外表达系统的反应条件。因此，本领域需要改良的抗体文库用于选择针对所需靶的scFv抗体。专利技术概述本专利技术通过提供改良的体外展示RNA文库以允许可靠表达和选择scFv抗体分子解决了前述问题。本专利技术具有几个优点，这包括但不限于下述 提供包含最优化的结构域间接头用于改善表达的改良的体外展示scFv抗体文库； 提供包含短核酸条形码(barcodes)的改良的体外展示scFv抗体文库； 提供引物以生成改良的体外展示scFv抗体文库； 提供引物以对本专利技术文库中的scFv抗体分子的重链可变区的CDR3区进行谱型分析 (spectratype)；禾口 制备改良的体外展示文库的方法。在一个方面，本专利技术提供了由如SEQ ID NOs 1-14、19-42、和58-210的任何一个中所示的核酸序列组成的寡核苷酸。在另一个方面，本专利技术提供了包括如SEQ ID NOs 1-14、19-42、和58-210的任何一个中所示的核酸序列的寡核苷酸。在另一个方面，本专利技术提供了由如SEQ ID NOs :14_16、和43_57的任何一个中所示的核酸序列组成的寡核苷酸。在另一个方面，本专利技术提供了包括如SEQ ID NOs 14-16, 和43-57的任何一个中所示的核酸序列的寡核苷酸。在另外一个方面，本专利技术提供了由如SEQ ID NOs 17或18中所示的核酸序列组成的寡核苷酸。在另一个方面，本专利技术提供了包括如SEQ ID NOs :17或18中所示的核酸序列的寡核苷酸。在一个实施方案中，本专利技术提供了 SEQ ID NOs 1_210中所示的任何序列用于文库扩增、文库逆转录和/或文库谱型分析的用途。在另一个方面，本专利技术提供了用于表达单链抗体(scFv)的核酸文库，所述文库包括编码重链可变结构域和轻链可变结构域的序列谱(repertoire)，其中所述文库的每个成员包含可读框，所述可读框包括重链可变结构域、轻链可变结构域和接头区域，并且其中所述文库使用SEQ ID NOs :1-210中所示的一种或多种寡核苷酸生成。在一个实施方案中，文库进一步包括编码小于20个氨基酸的接头区域。在另一个实施方案中，文库进一步包括编码15个氨基酸的接头区域。在一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括与可读框可操作地连接的启动子。在另一个实施方案中，启动子选自T7、SP6和T3。在另外一个实施方案中，启动子是T7 启动子。在一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括能够增强它与之可操作地连接的基因转录的5’非翻译区(5’UTR)。在另一个实施方案中，5’UTR是烟草花叶病毒5’UTR或其活性片段。在另一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括聚腺嘌呤序列。在另外一个实施方案中，文库进一步包括核酸条形码。在另一个实施方案中，核酸条形码包括8个核苷酸。在另一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括编码附加表位的核酸序列。在另外一个实施方案中，附加表位是FLAG标记。在另外一个实施方案中，核酸序列是scFv的接头区域的部分。在另一个实施方案中，文库进一步包括编码抗体恒定区或其片段的核酸序列。在一个实施方案中，文库进一步包括核糖体中止(pause)序列。在一个实施方案中，文库进一步包括肽接纳体。在另一个实施方案中，肽接纳体经由包括补骨脂素C6分子的接头共价附着。在另外一个实施方案中，接头是5’(补骨脂素 C6)2，Ome (U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (嘌呤霉素)，其中X是三甘醇接头或PEG-150，并且CC是DNA主链。在另一个方面，本专利技术提供了产生用于表达单链抗体(scFv)的核酸文库的方法， 其包括(a)提供核酸组合物，其中组合物中的至少部分核酸包括编码抗体可变结构域的至少一个可读框，和(b)使用SEQ ID NOs 1-210中所示的一种或多种寡核苷酸扩增多个抗体可变结构域。在另一个方面，本专利技术提供了用于对包括至少一个可读框的核酸进行谱型分析的方法，所述可读框编码抗体可变结构域，所述方法包括(a)提供核酸组合物，其中所述组合物中的至少部分核酸包括编码抗体可变结构域的至少一个可读框，和(b)使用SEQ ID NOs 1-210中所示的一种或多种寡核苷酸扩增所述可变结构域的CDR3区。附图简述附图说明图1描述了在本专利技术的特定实施方案中关于mRNA-scFv展示技术的一般方案。图2描述了在本专利技术的特定实施方案中关于mRNA-scFv展示技术的一般方案。图3描述了文库DNA构建体的一般描述。图4描述了作为mRNA-scFv分子生成的功能scFv。图5描述了显示在mRNA-scFv分子形式中附着的scFv在功能上等价于游离scFv5分子的结果。图6描述了在17/9 mRNA -scFv构建体的TMV-UTR和Kozak共有序列之间插入的 4个8-bp标记。图7描述了示例性构建体和控制序列。图8描述了在3轮选择中鉴定的随机标记序列。图9描述了在一轮mRNA-scFv选择前和后定量17/9 scFv的结果。图10描述了在D2E7和2SD4之间的嵌合体。图11描述了关于不同TNF α结合剂的Kd曲线。图12描述了 mRNA-scFv分子的热稳定性。图13描述了显示RNA可以在mRNA-scFv分子的高温处理后回收的结果。图14描述了在首次用于实验的人PBMC κ scFv PROfusion文库中PBMCs供体的年龄、种族划分和性别分布。图15描述了在构建的首次用于实验的人PBMC κ scFv PROfusion文库中的VH家族特异性PCR片段。图16描述了在构建的首次用于实验的人PBMC κ scFv PROfusion文库中的V κ家族特异性PCR片段。图17描述了在构建的首次用于实验的人PBMC κ scFv PROfusion文库中的VH_V κ scFv PCR 产物。图18描述了在构建的首次用于实验的人PBMC κ scFv PROfusion文库中的VH禾口 Vk家族分布。图19描述了首次用于实验的人PBMC抗体⑶R3大小的谱型分析。图20描述了 VH/V κ文库通过谱型分析的质量控制。图21描述了在首次用于实验的人PBMC λ scFv PROfusion文库中的V λ家族特异性PCR片段。图22描述了在构建的首次用于实验的人PBMC λ scFv PROfusion文库中的VH_V λ scFv PCR 产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种寡核苷酸，其由如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯｓ：１－１４、１９－４２、和５８－２１０的任何一个中所示的核酸序列组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：CM谢，
申请(专利权)人：雅培制药有限公司，
类型：发明
国别省市：US