加载结晶装置的方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及用于加载结晶装置和用于制造结晶装置的方法，所述结晶装置包括多个具有预定量的至少一种基质形成化合物的容器，所述基质形成化合物能形成膜蛋白结晶基质，所述方法包括以下步骤：ａ）将所述至少一种基质形成化合物的聚集状态改变成流体状态，从而允许对所述至少一种基质形成化合物进行分配，和ｂ）将确定量的所述至少一种基质形成化合物分配进所述结晶装置的至少一个容器中，所述分配的基质形成化合物在所述容器内固化。从而获得预填充的结晶装置，可用作消费品，尤其是用在自动结晶法中。本发明专利技术还提供了采用分别制备的结晶装置进行的蛋白质结晶方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物聚合物的结晶，具体涉及膜蛋白，以及涉及用基质形成化合物加载结晶装置的可自动化方法。
技术介绍
三维蛋白质结构具有非常高的商业价值，因为由此能合理(基于结构)设计和工程改造结合感兴趣的蛋白质的新颖药物分子。此外，由此能促进工程改造具有所需性质的新颖蛋白质。蛋白质和其他生物聚合物的三维结构通常通过对应晶体的X射线衍射确定。 为了通过X射线衍射结晶学对其进行观测，必须得到生物聚合物的高质量晶体。不幸的是， 蛋白质晶体生长科学目前无法预测特定蛋白质结晶时的条件。因此，再结合许多其他问题， 必须搜寻高度量纲化的参数空间(大量可能的配方/组合)以找到最佳的结晶条件。尽可能多地进行实验的简单筛选经常是最有效的方法。这是非常费力和消耗时间的。因此，制备高质量蛋白质晶体是通过X射线衍射结晶学阐释蛋白质结构的瓶颈。所以，已经作了许多努力来使该过程自动化进行，从而对许多不同的结晶条件进行筛选。膜蛋白是一大类与包裹所有活细胞的脂质双层(膜)结合或者横穿该脂质双层的蛋白质。膜蛋白通常涉及物质和/或信号穿过细胞膜的受控移动。这样，膜蛋白能在活细胞内部和外部之间进行快速交流。膜蛋白的例子包括离子通道，信号受体，激素受体，光受体和粘附蛋白。这些膜蛋白经常是药物开发的目标，是科学关注的中心，原因在于，它们涉及信号转导过程。膜蛋白的一种定义特性是，其表面上同时存在疏水性和亲水性区域。这样使得膜蛋白能结合进入膜的脂质双层(其构成膜的大部分)形成的疏水性区域中，同时在膜的任一侧与水性材料形成稳定界面。但是，这些特性使得难以通过用于可溶性(非膜约束)蛋白质的结晶方法，例如蒸汽扩散方法来结晶膜蛋白。膜蛋白容易变性，所以其结构在水性溶剂中变松散。因此，结晶膜蛋白是特别具有挑战性的。但是，由于膜蛋白由所有已知基因组中约30%的基因组编码，它们的结构引起了很大的兴趣。在1996年，Landau和Rosenbusch描述了脂质立方相用于膜蛋白结晶的新颖应用。 根据这种方法，将洗涤剂增溶的膜蛋白与结晶基质形成化合物如油酸单甘油酯(或棕榈酸单甘油酯)和水(或缓冲液)混合，然后进行多次离心。通过这种方法，得到粘稠的双连续立方相，一种固化的脂质双层，以三维方向延伸，能被水性通道透过。所以，基质形成化合物油酸单甘油酯能形成膜蛋白的结晶基质，因为其提供适用于膜蛋白的脂质双层结构。膜蛋白能分配到脂质双层中，能以三维方向在其中扩散，从而扩散到许多可能的空间折叠构造中，导致蛋白质在脂质中间相(例如所谓脂质立方相或海绵相)中进行晶体生长。对应的脂质立方相的一个例子如附图说明图1中所示。所以对应相是非常合适的膜蛋白结晶基质。此后，除了油酸单甘油酯以外还鉴定了其他的也能形成合适的膜蛋白结晶基质的基质形成化合物，用于结晶膜蛋白。膜蛋白和其他聚合物的结晶仍然是很有挑战性的。对于膜蛋白结晶基质(例如中间相、海绵相和立方相)，其操作和形成是特别困难的。具体来说，进行实验是非常耗费时间的。仅仅数次结晶实验通常就需要一个实验者耗费一天时间。由于要找到头绪经常需要测试大量的结晶条件，所以这种测试方法是人们所不希望的，因为其涉及过多的操作步骤。此外，还必然造成测试材料的浪费。由于开始的测试材料(例如基质形成脂质和蛋白质)是专用的，所以这种对材料的浪费经常导致无法进行足够数量的测试。在现有技术中，基本上有两种方法来形成生物聚合物结晶基质，尤其是对膜蛋白而言。根据一种方法，在水溶液中混合膜蛋白和基质形成化合物(例如脂质，如油酸单甘油酯)，从而形成脂质立方相，其中在由基质形成化合物如油酸单甘油酯形成的结晶基质(立方相)中重建膜蛋白。然后将所述脂质立方相转移到分配器中。然后将脂质立方相从分配器分配到结晶装置的容器中，例如多孔板。然后向分配的脂质立方相中加入结晶所必需的其他组分，例如沉淀液等，从而引发结晶过程。这种方法见述于例如US 2002/0072703。但是，这种方法需要大量蛋白质以形成蛋白质和基质形成脂质化合物的“主混物”，从而在分配之前形成结晶基质(如立方相)，这些是常规情况下无法获得的。这种方法的另一个缺点是，例如无法改变基质形成化合物的性质进而为感兴趣的具体蛋白质找到最佳的基质形成化合物，因为蛋白质预先与基质形成化合物混合。因此，还需要制备蛋白质和脂质立方相的几种“主混物”，这是消耗蛋白质的，否则就无法改变基质形成化合物。此外，必须由使用者手动地混合膜蛋白和脂质基质形成化合物。由于立方相是粘性的，所以难以对形成的对应立方相进行分配，因此该方法是耗费时间的，或者至少容易出错。另一个问题在于，无法分别控制沉淀液对立方相和蛋白质的影响，因为立方相和蛋白质的混合物与沉淀液发生接触。不同种类的沉淀剂引起立方相的不同变化。在使膜蛋白溶液接触立方相之前进行分析可能是令人感兴趣的。因此，目前首先将基质形成化合物与蛋白质组合的方法限制了对基质形成化合物、膜蛋白和沉淀液的理想组合进行筛选的能力。另一种方法采用基质形成化合物的手动制备，将非常少量的纯的基质形成混合物称量到结晶装置的容器，例如多孔板中。然后向制备的基质形成化合物中加入蛋白质溶液， 以引发结晶基质的形成。在这方面，以确切的比例/浓度将基质形成化合物与膜蛋白混合是很重要的。因此，必须尽可能落实/限定结晶装置的容器中包含的基质形成化合物的量。 但是这很困难，因为根据基质形成化合物的脂质性质，其通常为固体化合物。对于经常以片状条件存在的对应的固体化合物如油酸单甘油酯，要进行称量是很困难的，也是非常耗费时间的过程，考虑到要在一次结晶实验中理想地筛选可能几百种或甚至几千种不同条件就能理解这一点。因此，对于中等或高通量的结晶实验，单独称量基质形成化合物的限定量是不合适的。此外，由于对理想和可重复的结晶实验而言，必须提供立方相和膜蛋白的确切比例，所以称量过程也是容易产生误差的。为了鉴定理想的结晶条件并优化结晶过程，仍然存在许多需要改进的方面，尤其是当只有少量蛋白质的时候。因此，本领域中非常需要可自动化进行的过程，从而能够对结晶条件进行中等和高通量的筛选。专利技术概述根据本专利技术的第一实施方式，提供了一种，该结晶装置包括多个具有预定量的至少一种基质形成化合物的容器，所述基质形成化合物能形成膜蛋白结晶基质，所述方法包括以下步骤a)将所述至少一种基质形成化合物的聚集状态改变成流体状态，从而允许对所述至少一种基质形成化合物进行分配，和b)将限定量的所述至少一种基质形成化合物分配到所述结晶装置的至少一个容器中，其中所述分配的基质形成化合物在所述容器中固化。能形成膜蛋白结晶基质的基质形成化合物(以下也称为“基质形成化合物”)通常在室温下为固体(见以上)。因此，现有技术将单独量的固体化合物称量到容器中。如以上概述的，这是耗费时间、容易产生误差的，因此不适合自动化过程。本专利技术不同于该方法， 本专利技术使所述基质形成化合物的聚集状态改变成流体状态，从而允许将所述至少一种基质形成化合物分配到结晶装置的容器中。例如，根据所用的分配器，只需改变聚集状态，使得基质形成化合物以粘稠状态(或液体)存在，从而形成可分配的聚集状态，就足以进行本专利技术。因此，可以将限定量的所述至少一种基质形成化合物分配到结晶装置的容器中。对应的过程也是可自动化进行的，因为流体形式的基质形成本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用预定量的至少一种能形成膜蛋白结晶基质的基质形成化合物加载包括多个容器的结晶装置的方法，该方法包括以下步骤：ａ）将所述至少一种基质形成化合物的聚集状态改变成流体状态，允许对所述至少一种基质形成化合物进行分配，和ｂ）将确定量的所述至少一种基质形成化合物分配到所述结晶装置的至少一个容器中，其中所述分配的基质形成化合物在所述容器内固化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·库比西克，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：发明
国别省市：DE