培养细胞的方法技术

提供了用于保持了干细胞潜能的分化的人类细胞的培养的方法。所述方法包括培养锚定到微载体的保持了干细胞潜能的分化的人类细胞，所述微载体选自由明胶微载体和季铵衍生化的聚苯乙烯微载体构成的组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及培养保持了干细胞潜能的分化的人类细胞的方法。干细胞和具有干细胞潜能的细胞在许多治疗领域越来越被关注。这样的细胞一般通过培养锚定在固相支持培养基上的细胞来产生。小鼠胚胎干细胞已经显示了在Sigma SoloHill (纤连蛋白包被的聚苯乙烯)和Cytodex 3 (胶原蛋白)微载体上在搅动的悬浮培养物中生长。(i^ok EY et al, Stem Cells 2005, 23 (9): 1333-42)。猪的骨髓衍生的原代间质干细胞已经显示了在Cytodex 1、2和3型(胶原蛋白)微载体上生长(Frauschuh S et al, Biotechnol Prog. 2007，23 (1): 187-193)。猫的胚胎肺成纤维细胞已经显示在波浪和搅动罐生物反应器中在Cytodex 1上生长(Hundt B et al, Vaccine 2007, 25(10): 3987-95)。小鼠胚胎干细胞也显示了在旋转烧瓶中在Cytodex 3微载体上生长(Abranches E et al, Biotechnol Bioeng. 2007, 96 (6): 1211-21)。在产生本专利技术的研究期间，发现的是，这样的微载体受到许多缺陷的困扰，使得它们不适合于保持了干细胞潜能的分化的人类细胞的可靠的和可规模化的生产。US2007/0264713公开了，可以采用许多不同的微载体来生长许多不同类型的干细胞。在人类胚胎干细胞的培养中举例了明胶微载体以及胶原蛋白微载体。结果显示了， 胶原蛋白微载体得到了为明胶微载体三倍大的细胞增加。根据本专利技术的一个方面，提供了培养保持了干细胞潜能的分化的人类细胞的方法，其包括培养锚定在微载体上的保持了干细胞潜能的分化的人类细胞，所述微载体选自由明胶微载体和季铵衍生化的聚苯乙烯微载体构成的组。所述细胞通过本领域已知的方法锚定在所述微载体上，例如，包括通过附着到微载体的表面，通过附着到大孔微载体的内部结构，或通过在大孔微载体的内部结构之内的物理俘获。可以在本专利技术的方法中采用的明胶微载体可以由明胶颗粒、交联的明胶颗粒或用作载体材料上的包被物的明胶组成，所述载体材料例如聚苯乙烯或玻璃颗粒。明胶可以是天然来源的，或是重组地或合成地生产的。明胶或胶原蛋白可以通过赖氨酸的胺基基团、通过谷氨酸或天冬氨酸的羧基基团、或其组合来交联。明胶微载体一般是近似球形的，但可以具有其他形状，可以是多孔的或实心的。多孔的和实心型的微载体都是商业上可获得的。微载体可以具有带有凹痕的密实表面以便于细胞的锚定。例如，大孔明胶微载体可从Percell Biolytica AB, Sweden 以商品名称 Cultispher，特别是 Cultispher G 和 Cultispher S 来获得。明胶大孔微载体一般包含基于高度交联的明胶基质的颗粒，常常具有10-500 μπι的颗粒大小，形成包围了一般具有1-50 μ m直径的大量空腔的聚合物基质。通常选择微载体的颗粒大小范围以足够大来容纳干细胞的锚定，而又足够小以形成具有适用于细胞培养物生物反应器的性质的悬浮物，所述生物反应器例如摇瓶、滚瓶、旋转烧瓶、波浪(wave)生物反应器和搅拌罐生物反应器系统。可以在本专利技术中采用的季铵衍生化的聚苯乙烯微载体包含附着于聚苯乙烯的氨基基团，所述氨基基团被季铵化，优选的通过三个烷基基团，特别是三个CV4烷基基团。这样的微载体的实例包括 HyQSphere HLXl 1-170，可从 Hyclone/ThermoFisher ScientificInc.商业上获得。明胶微载体特别适合于一些应用，其中细胞在不同批次的微载体上培养，其中细胞在第一批次的微载体上培养，然后扩大培养规模，收获细胞并且然后任选地在保存一段时间之后，例如，在冷冻器中保存后，再次附着到微载体，一般是更大批量的微载体上，或总和起来更大数量微载体的多个培养器上。这样的培养-收获和再附着可以按照生产期望数量的细胞所需的频繁度来重复。明胶微载体可以用作起始的微载体或用作随后的微载体， 或可选择的微载体，特别是季铵衍生化的聚苯乙烯微载体，可以被采用作为起始微载体，随后收获后的再附着为到明胶微载体。季铵衍生化的聚苯乙烯微载体适合于一些应用，其中细胞接种到微载体上和在该微载体上培养直到收获，没有分离和再附着，或作为起始微载体，带有随后的收获和对明胶微载体的再附着。另外，季铵衍生化的聚苯乙烯微载体可以被采用作为最终的微载体，其他微载体被采用用于较早的培养步骤。可以通过本专利技术的方法生产的保持了干细胞潜能的分化的人类细胞是本领域已知的，优选地是成体细胞，特别是间充质细胞，最优选地是真皮细胞，包括adiposyte细胞。 特别优选的细胞包括真皮鞘细胞、真皮成纤维细胞和真皮乳头细胞，特别是EP-A-0980270 中描述的真皮鞘细胞，US5851831中描述的真皮乳头细胞，最特别地是共同待决英国专利申 it no. 0913469. 3 中描述的真皮纤维形成细胞(dermal fibroplast cells)。根据本专利技术方法可以在本领域已知的容器中进行，包括组织培养烧瓶、摇瓶、旋转烧瓶、搅拌罐生物反应器、基于可弃袋的生物反应器系统，例如波浪细胞培养物系统，和膨胀床生物反应器系统。大规模生产的选项还包括滚瓶、空心纤维系统、单片、多片或堆叠的平板培养系统和单元立方体。本专利技术的方法通常通过在搅拌罐培养容器系统中培养细胞来进行。一般地，细胞、 微载体和营养培养基被提供给培养容器，并在有助于细胞增殖的条件下保存。如果期望， 其他的培养培养基可以添加到培养容器系统，直到培养最后终止和收获细胞。本专利技术的方法通过在有助于细胞生长同时保持细胞的干细胞潜能的条件下培养细胞来进行。培养物条件，例如，温度、PH值、溶解氧(包括低氧条件)等等，是已知对特定细胞最佳的那些条件， 对于技术人员是显而易见的(参见，例如，Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed. , Rickwood, D. and Hames, B. D. , eds. , Oxford University Press, New York (1992))。一般地，细胞在约中性pH的pH值下，通常在6. 5到7. 5的范围内，以及在约30 到38°C的范围内的温度下培养。在本专利技术的某些方面中，细胞在用搅拌器搅动的容器中培养，所述搅拌器包含位于培养容器内不同深度的两个或更多个叶轮，通常为旋转搅拌子(stirrer)。优选的，所述叶轮在共同的轴周围固定。在采用两个叶轮时，一个叶轮优选地位于接近培养容器中培养基的底部，例如，在容器的下三分之一处内，第二叶轮位于接近容器中培养基的中部，例如， 在中间三分之一内，或接近容器中培养基的顶部，例如在上三分之一处内。在许多实施方式中，每个叶轮包含两个、三个或四个叶片，其相对叶轮轴的轴线成角度，例如螺旋桨型叶片。优选的，其中旋转的搅拌子被用作叶轮，选择搅拌子以使搅拌子直径容器直径比为至少0. 25 :1，例如，在0. 3 :1到0.7 1的范围内。在本专利技术的其他方面中，细胞在用搅拌器搅动的容器中培养，所述搅拌器包含至少一个螺旋叶片，优选的如国际专本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于保持了干细胞潜能的分化的人类细胞的培养的方法，其包括培养锚定到微载体的保持了干细胞潜能的分化的人类细胞，所述微载体选自由明胶微载体和季铵衍生化的聚苯乙烯微载体构成的组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·V·卡拉，
申请(专利权)人：富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB