环境适应性转基因植物制造技术

本发明专利技术涉及一种对盐胁迫具有耐受性的新型转基因植物。用编码分离自水稻的谷氨酸脱羧酶的重组核酸转化所述植物。本发明专利技术还涉及一种生产所述耐盐性转基因植物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及耐盐性转基因植物。具体而言，本专利技术涉及表达谷氨酸脱羧酶的转基因植物，以及制备这样的转基因植物的方法。
技术介绍
盐度胁迫对全世界的农业产量具有不利影响，无论对于自给性还是经济性收获， 生产均会受到影响。植物对盐度的应答由大量过程组成，它们必须协调发挥作用以同时减轻细胞高渗透压(hyperosmolarity)和离子不平衡。此外，作物必须能够在盐环境中实现令人满意的生物量生产。在本专利技术中，提供了通过植物遗传工程制备耐受环境应激的能力增强并具有所需形态学和/或农艺学特征等的植物的方法和材料。更具体而言，本专利技术涉及用增强植物合成谷氨酸脱羧酶的能力的基因对植物进行遗传转化，所述谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸转化为GABA从而增强植物耐受应激的能力，或赋予其它所需特征。作为本专利技术的背景知识，已显示GAD酶(谷氨酸脱羧酶)催化谷氨酸形成Y -氨基丁酸(GABA)，已克隆了若干植物的GAD基因。接触到应激后植物细胞中迅速累积GABA已被文献充分证明。GAD促进谷氨酸发生脱羧反应产生GABA被认为是接触应激之后植物中累积GABA的主要来源。然而，也可通过其它代谢途径如与多胺分解代谢相关的代谢途径或通过可逆的GABA氨基转移酶反应引起的GABA旁路的一部分来生物合成GABA。用大豆子叶或芦笋细胞悬浮培养物进行的实验表明，通过谷氨酸代谢形成GABA是正常现象，GABA的生物合成并不是研究条件下对应激的应答。然而，还显示GABA在受到机械性刺激、温度变化如冷激或热激条件时在植物中迅速累积。鉴于该背景知识，可看出已为研究植物中的GABA合成和GAD酶活性付出了诸多努力；然而，尚未表明GABA赋予植物盐度耐受性中的直接作用。本专利技术是本领域中的重大进止少ο现有技术耐盐性的机制生物学家关于盐生植物(适应盐性生存环境的植物)对高浓度NaCl的耐受性不大于非盐生植物(也称为嫌盐植物或适应甜水的植物)的早期发现是所有耐盐性机制的基础(Munns 2002)。例如，从盐生植物滨藜(Atriplex spongeosa)或海滨碱蓬(Suaeda maritima)提取的酶在体外对NaCl的敏感性与从豆或豌豆提取的酶相同(Greenway和 Osmond 1972 ；Flowers等1977)。甚至是可在高于海水10倍以上盐度下生长的粉红色盐湖藻类巴夫杜氏盐藻(Dunaliella parva)的酶对NaCl的敏感性也与最敏感的嫌盐植物相同 (Munns等综述1983)。Na+通常在高于IOOmM的浓度开始抑制大多数酶。对Cl_产生毒性的浓度的说明更少，但可能在与Na+相同的范围内。甚至K+也可在100-200mM的浓度下抑制酶(Greenway 和 Osmond 1972)。因此，耐盐性的机制有两个主要类型最大程度减少盐进入植物的机制和最大程度减少胞质中盐浓度的机制。盐生植物同时具有两种机制，它们充分地“排除”盐，但有效地将不可避免进入的盐隔离在液泡中。这使得它们能在盐性土壤中长时间生长。一些嫌盐植物也充分排除盐，但不能如盐生植物那样将吸收的其余盐有效隔离。大多数嫌盐植物排除盐的能力差，盐在蒸腾叶中聚集到毒性水平。高盐度条件对大多数植物造成高渗损伤，升高的Na+浓度通过干扰至关重要的 Na+敏感酶和通过影响关键的离子运输来破坏细胞过程。认为在盐性条件下通过多个Na+ 可渗透通道/转运蛋白进行Na+摄入，在胞质Na+浓度达到某阈值水平时触发离子毒性 (Volkamar等，1999 ；Hasegawa等，2000)为通过遗传方法增强植物的耐盐性，应采取合理的策略方法以赋予植物针对上述应激的抗性。大多数植物合成并累积渗压剂，即所谓的相容性溶质，作为对干旱或高盐度条件的应答。这些相容性溶质在生理PH下呈中性，分子量低，水溶性高，即使在胞质溶胶中高浓度累积时对生物体也不具有毒性。引入生物合成渗压剂基因的一些转基因植物显示改善的高渗耐受性，上述渗压剂如甘露醇(Tarczynski等， 1993),4-0-甲基内消旋肌醇(ononitol) (Sheveleva 等，1997)、海藻糖(Holmstriim 等，1996；Romero 等，1997)、脯氨酸(Kishor 等，1995)、甜菜碱(Lilius 等，1996 ；Hyashi 等，1997；Sakamoto 等，1998)或果聚糖(Pilon-Smits 等，1995)、嗜盐菌盐单胞菌(Halomonas elongate)中的相容性溶质艾可托英(ectoine) (1,4,5,6-四氢_2_甲基_4_嘧啶羧酸)、 肌醇(Das-Chatter jee等，2006)。作为另一个策略，据报道，编码调节应激耐受性基因表达的转录因子的拟南芥(Arabidopsis thaliana)DREBIA基因的过表达会改善转基因植物对干旱、盐度和严寒的耐受性(Kasuga等，1999)通常难以对Na+毒性耐受性进行分子水平的改善。关于通过过表达拟南芥中的液泡Na+/H+反向转运蛋白基因(NHXI)或液泡质子泵基因(AVPZ)来改善耐受性的报道很少(Apse等，1999)。我们现在对通过引入编码谷氨酸脱羧酶的水稻(Oryza sativa)GAD基因增强植物细胞的盐胁迫耐受性进行说明。GABA 旁路Y-氨基丁酸(GABA)是含四个碳原子的非蛋白质氨基酸，在细菌、植物和脊椎动物中具有保守性。GABA是游离氨基酸池的重要组分。GABA在γ碳而非α碳上具有氨基， 以未结合的形式存在。它具有高水溶性就结构而言，它是柔性分子，可在溶液中采取若干构象，包括与脯氨酸1类似的环状结构。GABA在生理ρΗ值(ρΚ值为4. 03和10. 56)下为两性离子(同时携带正电荷和负电荷)。这于半个多世纪前在植物中发现，但揭示GABA在大脑中以高水平产生并在神经传递中发挥主要作用时，对GABA的兴趣转移到了动物上。此后，在脊椎动物中对GABA的研究就主要集中在其作为信号传导分子特别是在神经传递中的作用上。在植物和动物中， GABA主要经包含三种酶的短途径进行代谢，所述短途径称为GABA旁路，因为它绕过了三羧酸(TCA)循环中两个步骤。所述途径包含胞质酶谷氨酸脱羧酶(GAD)与线粒体酶GABA氨基转移酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)。该保守代谢途径的调节在植物中似乎具有特定特征。经GABA将谷氨酸转化为琥珀酸的途径称为GABA旁路。该旁路的第一步是通过谷氨酸脱羧酶(GAD，EC 4. 1. 1. 15)对谷氨酸进行直接和不可逆的α -脱羧化。已在多个植物种类和组织的粗提物中对体外GAD活性进行了鉴定(Brown和Sielp，1989)。GAD对 L-谷氨酸具有特异性，具有吡多醛5’-磷酸依赖性，受已知与巯基反应的试剂的抑制作用， 具有钙调蛋白结合结构域，显示约5. 8的明显酸性的最适宜ρΗ。已鉴定了来自矮牵牛花(Baum 等，1993)、番茄(Gallego 等，1995)、烟草(Yu 和 Oh, 1998)和拟南芥(Zik 等，1998) 的GAD基因。参与GABA旁路的第二个酶是GABA氨基转移酶(GABA-T ；EC 2. 6. 1. 19)，其将丙酮酸或α-酮戊二酸作为氨基受体，催化GABA本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种产生显示对环境应激的耐受性增强的转化植物的方法，其包括：将包含与编码功能性谷氨酸脱羧酶（ＧＡＤ）的核苷酸序列操作性连接的启动子的ＤＮＡ构建体引入到植物基因组中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·M·帕特尔，
申请(专利权)人：阿维斯塔根有限公司，
类型：发明
国别省市：IN