本申请公开了简便且有效地在一个培养步骤中培养疾病抗原特异的ＣＴＬ和γδＴ细胞的方法；以及使用通过所述方法产生的细胞的医药品和治疗／预防方法。收集血液并且自该血液分离外周血单核细胞。在培养开始时向外周血单核细胞添加氨基二膦酸和疾病抗原，通过进行预定期间的细胞培养来同时增殖／诱导疾病抗原特异的ＣＴＬ和γδＴ细胞直至细胞数达到对于疾病治疗有效的值。由此产生的ＣＴＬ和γδＴ细胞用于治疗。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在癌治疗中同时且有效地培养抗原特异的CTL和γ δτ细胞的技术。 更具体地，本专利技术涉及使用该培养技术培养的细胞的医药用途。
技术介绍
近来，免疫细胞疗法作为包括癌症在内的难治性疾病的新疗法而受到关注。免疫 细胞疗法是收集并活化患者自身的免疫细胞，特别是白细胞，然后再将它们返回患者体内 来人工地增强免疫力。与常规的抗癌剂治疗等比较，这种疗法具有减少的副作用的优点。作为免疫细胞疗法，活化自体淋巴细胞的疗法已经普及，所述疗法涉及体外用淋 巴因子实施抗原非特异地活化淋巴细胞，然后将它们返回身体；但是，需要获得利用细胞毒 性T淋巴细胞(下文中称为CTL)的疗法，其中所述细胞毒性T淋巴细胞具有更强的细胞毒 活性并特异地识别和破坏病变。这里，作为当前尝试的利用CTL的治疗法，例如采用直接将癌抗原肽等施与患者 的方法；但是，在这种情况下，由于患者通常具有低下的免疫力，其诱导CTL的能力需要提 高。因此，有树状细胞疫苗疗法等，所述疗法涉及将抗原与抗原呈递细胞如树状细胞(下文 中也称为DC)等接触，并因此强烈地引起细胞呈递抗原，由DC在体内诱导疾病抗原特异的 CTL。下面显示的是一些目前诱导疾病抗原特异的CTL的典型方法。例如，在非专利文献1和2中，将9-mer肽如特定疾病抗原的表位添加至外周血单 核细胞来尝试由其诱导CTL。此外，在非专利文献3和4中，从外周血单核细胞获得DC并向 其添加抗原肽，来赋予抗原呈递功能；将自外周血淋巴细胞分离的CD8阳性T细胞与所获得 的DC —同培养来诱导疾病抗原特异的CTL。进一步地，在非专利文献5中，使用获自造血前体细胞的DC和抗原肽进行DC接 种，然后将向其添加了抗原的单核细胞来源的DC与分离自外周血单核细胞的CD8阳性T细 胞共培养以诱导抗原特异的CTL。从上述例子中它们的用途可以获知，在其它抗原呈递细胞中，树状细胞具有高的 抗原呈递能力并且能够诱导疾病抗原特异的CTL，因此，正在进行获得它们的技术开发。但是，为了获得用于树状细胞接种的树状细胞，通常需要收集人外周血，从外周血 分离称为单核细胞的细胞，并在添加IL-4、GM-CSF等后培养它们。该方法繁琐并且目前存 在这样的问题，取决于细胞培养技术人员的水平，所培养细胞的数量和功能是变化的。Y δ T细胞是非肽抗原活化的细胞，是负责天然免疫的细胞；近来发现这些细胞 对癌细胞具有MHC非限制性细胞毒活性(非特异的活性)。因此，研究了使用这些Y δΤ细 胞的强抗癌活性的免疫疗法。由于Y δ T细胞通过识别非肽抗原而活化，它们可以被例如烷基胺或二膦酸作为 非肽抗原刺激，从而活化和/或增殖；已经在体外引起分离自外周血的Y ST细胞识别非肽 抗原来研究其活化和/或增殖(例如，非专利文献6)。但是，问题是γ δ T细胞通常在外周血中以仅1至5%的量存在，收集少量的血液 然后从其活化和/或增殖Y ST细胞不能确保Y δT细胞的纯度和数量足够用于治疗。增 加自患者收集的血液量来确保Y ST细胞的纯度和数量足够用于治疗也有对患者是一个 很大的负担的问题。专利文献1也公开了通过添加二膦酸至外周血单核细胞来活化和/或增殖Y δ T 细胞的方法。因此更有效的细胞培养和利用对免疫细胞疗法是重要的；现在正在进行多种多样 的方法和技术的研发。此外，在免疫细胞疗法中现在是主要培养一种类型的细胞并用于治疗；但是，考虑 到如上所述的例如疾病抗原特异的CTL以MHC限制性方式，例如，特异地针对MHC I类呈递 的抗原，攻击目标细胞或组织；和、S T细胞以MHC非限制性方式攻击细胞或组织，可以混 合多种细胞并用于治疗。但是，在实践中，对于培养多种类型的免疫细胞用于治疗，不得不对多种细胞类型 同时平行地实施培养步骤。适用于每一类型细胞的培养条件相互间不相同；如果使用常规 的适用于一种类型细胞的培养方法，它将非常难于例如同时且有效地培养足够数量的疾病 抗原特异的CTL和γ δ T细胞来发挥治疗效果；目前还没有这样的有效培养方法和诱导方 法。现有技术文献专利文献专利文献1 :W0 2006/006720非专利文献非专利文献 1 =Sugiyama H.等人，Cancer Immunol. Immunother.，2002 年 12 月； 51(11-12) :614-20. Epub，2002 年 10 月 18 日。非专利文献2 =Appella E.等人，J. Immunol.，1995 年 3 月 1 日；154(5) :2257-65非专利文献3 =Fujita S.等人，Blood，2000 年 1 月 1 日；95(1) :286_93。非专利文献4 =Yasukawa M.等人，Clin. Cancer Res.，2002 年 8 月；8(8) 2626-31。非专利文献5 =Palucka AK.等人，J. Exp. Med.，2004 年 6 月 7 日；199 (11) 1503-11，Epub，2004 年 6 月 1 日.非专利文献 6:Fumi Miyagawa 等人，The Journal of Immunology, 2001 ； 166 (9) 5508-5514。专利技术概述技术问题鉴于上述情形，本专利技术的课题是在一步培养中同时且有效地诱导和培养足够数量 的疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞用于发挥治疗效果。解决问题的手段本专利技术人为了解决这些问题进行了多种研究，并专利技术了本专利技术。本专利技术如下。(1)同时诱导疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的方法，特征在于，包括以下步骤 添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血并培养所得到的外周血；( 根据项(1)的同时诱导4疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中添加疾病抗原和氨基二膦酸的步骤在培养 开始第1日实施；(3)根据项(1)或(2)的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方 法，其中氨基二膦酸是帕米膦酸(pamidronic acid)、阿仑膦酸(alendronic acid)、唑来膦 酸(zoledronic acid)、禾丨J塞膦酸(risedronic acid)、伊班膦酸(ibandronic acid)、英卡 膦酸(incadronic acid)、其盐和/或其水合物；(4)根据项(1)至( 任一项的同时诱导 疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中疾病抗原是癌抗原；(5)根据项(1)至(4) 任一项的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中同时添加疾病抗原和氨 基二膦酸；(6)医药品，其包含通过项⑴至(5)任一项的方法获得的疾病抗原特异的CTL 和Y δΤ细胞；和(7)治疗/预防方法，其包括施与通过项(1)至( 任一项的方法获得的 疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞。作为研究结果，本专利技术人发现在外周血中通过氨基二膦酸活化的Y δ T细胞增殖 并且这些活化和增殖的Y S T细胞显示发挥APC(抗原呈递细胞)的功能，其呈递疾病抗原 并也促进疾病抗原特异的CTL的诱导，从而完成了本专利技术。专利技术的效果在用于疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的培养和诱导的常规方法中，通过多个 步骤获得所希望的细胞和然后开始培养；但是，本专利技术在一步培养中能本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．同时诱导疾病抗原特异的ＣＴＬ和γδＴ细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血和培养所得到的外周血。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：贽田美江，
申请(专利权)人：迈世耐特股份公司，
类型：发明
国别省市：JP
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