本发明专利技术开发了能够由ＤＡＯ酶缺损小鼠与其他疾病模型小鼠的交配实验中生产的多个动物中迅速筛选Ｄａｏ－／－的纯合体、并对多个样品中所含的Ｄ－氨基酸迅速进行定量测定的评价方法。本发明专利技术提供一种试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成的影响的评价方法，所述评价方法包括以下步骤：准备Ｄａｏ１－／－小鼠等的步骤、将前述Ｄａｏ１－／－小鼠等的活体组织等暴露于前述试验条件下的步骤、和对将前述Ｄａｏ１－／－小鼠等的活体组织等暴露于前述试验条件下造成的影响进行分析的步骤。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成 的影响的评价方法、用于实施该评价筛选方法的评价系统、和使用该评价系统的医药品和/ 或化妆品候补物质。
技术介绍
除甘氨酸以外的全部氨基酸均存在D型和L型这2种光学异构体。L-氨基酸用于 生物的蛋白质合成，蛋白质中所含的氨基酸大部分是L-氨基酸。与此相对，D-氨基酸存在 于部分低等生物的生理活性肽中，很多都是经由翻译后修饰的过程而被生物合成。因此，构 成蛋白质或肽的氨基酸主要是L-氨基酸，D-氨基酸是例外的存在。D-氨基酸是细菌的细胞壁的肽聚糖的构成成分。此外，关于不构成肽的游离的 D-氨基酸，一直以来报道存在于水栖动物、昆虫等低等动物中。但是，有一段时期相信存在 于高等动物中的氨基酸为L型、D型仅微量存在(非专利文献1)。非专利文献1 =Corrigan J. J. ,Science 164 :142-149(1969)但是，关于包括人在内的哺乳动物类中的D-氨基酸的存在和其作用，由于近年来 的以光学拆分法为首的分析方法的进步而终于得到阐明(非专利文献幻。通过使用了抗 D-天门冬氨酸抗体的双重染色法等，从而阐明了 D-天门冬氨酸在大鼠脑垂体中局部存在 于产生催乳素的细胞中。此外，通过对大鼠脑垂体来源的细胞株中合成、分泌催乳素的细胞 给予D-天门冬氨酸，从而催乳素分泌出现用量依赖性增加。根据以上事实可以认为，在产 生催乳素的细胞中D-天门冬氨酸控制着催乳素的分泌(非专利文献3)。非专禾Ij文献 2 :Hamase K, Morikawa A, and Zaitsu K.、J Chromatogr B 781 73-91 (2002)非专利文献3:D' Aniello A 等、FA SEB J 14 :699-714(2000)另一方面，据报道，在大鼠精巢的静脉中总是检测到比其他静脉血更高浓度的 D-天门冬氨酸，而且通过对从大鼠精巢分离、纯化得到的Leydig细胞给予D-天门冬氨酸， 睾酮的合成及分泌得到用量依赖性促进(非专利文献4)。非专利文献4 =Nagata Y 等、^BS Lett. 444 160-164 (1999)据报道，D-丝氨酸选择性地刺激推测与精神分裂症有关的NMDA受体的甘氨酸结 合位点，通过增强介由谷氨酸的该受体发挥的作用，从而促进神经传导(非专利文献幻。实 际上报道了通过投与D-丝氨酸来改善精神分裂症，以及精神分裂症患者血清中的D-丝氨 酸浓度低于健康人。非专利文献5 :Nishikawa T.Biol. Pharm. Bull. 28 :1561-1565(2005)作为与皮肤科学相关的认识，有报道称D-天门冬氨酸存在于像晶状体那样的不 易发生蛋白质代谢的组织中(非专利文献6)。此外，有报道称D-天门冬氨酸在皮肤中存 在于老年受试者的受日晒的皮肤的弹性纤维中，但不存在于没有受日晒的皮肤的弹性纤维 中，所以暗示了 UV暴露与皮肤的弹性纤维中的D-天门冬氨酸形成是强烈相关的(非专利文献7)。非专利文献6:Fujii N.Biol. Pharm. Bull. 28 :1585-1589(2005)非专禾Ij文献 7:Fujii N.等、Biochem. Biophys. Res. Commun. 294， 1047-1051(2002)然而，在探索包括人在内的哺乳类中的D-氨基酸的存在及作用的过程中，较大障 碍是D-氨基酸快速分解。在D-氨基酸的分解中，首先，D-氨基酸通过D-氨基酸氧化酶(EC 1.4. 3. 3，以下称为“DA0酶”。)而发生氧化脱氨基化，转变成对应的α-酮酸。然后α -酮 酸通过转氨酶而转变成对应的L-氨基酸。DAO酶是仅特异性地氧化D-氨基酸的酶，在肾脏 及其他脏器中表达(非专利文献8)。非专禾丨J文献 8 :Hamase K. , Konno R. , Morikawa A. and Zaitsu K.、Biol. Pharm. Bull. 28 :1578-1584(2005)DAO酶在小鼠中由第5染色体上的Daol基因编码，已报道了 ddY小鼠中的该基因 的错义突变体(非专利文献9)。在该突变基因(Daoe或Da,8，中，第181位的Gly残基 被置换成Arg残基，产生丧失了酶活性的蛋白质。因此，失去DAO酶活性的表型进行隐性遗 传。在隐性纯合体的个体(以下称为“DA0酶缺损小鼠”。)中D-丙氨酸及D-丝氨酸的血 中浓度上升至5 8倍，表现出共济失调(ataxia)及定型行为(stereotypic behavior) (非专利文献10)。关于DAO酶缺损小鼠与其他疾病模型小鼠的交配实验未有报道。非专利文献 9 =Konno R. and Yasumura Y.、Genetics 103 :277-285(1983)# # ^lJ i K 10 :Hashimoto Α. ， Yoshikawa Μ. ， Niwa A. and Konno R. 、Brain Res.1033 :210-215(2005)
技术实现思路
专利技术要解决的问题需要从DAO酶缺损小鼠与其他疾病模型小鼠的交配实验中生产的多个动物中迅 速筛选Day/DaJ—的纯合体。此外，由于有时D-氨基酸的存在量只有L-氨基酸的存 在量的约以下，所以需要从大量的L-氨基酸中分离并检测出微量的D-氨基酸。进而， 需要迅速地对多个小鼠个体来源的样品、多个不同组织来源的样品、多个暴露于试验条件 下的样品中所含的D-氨基酸进行定量测定。用于解决问题的方案本专利技术提供试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成 的影响的评价方法。前述评价筛选方法包括以下步骤(1)准备具有Dao 的基因型的小 鼠、和具有Daol+的基因型的小鼠的步骤；(2)将前述具有Daol+/+的基因型的小鼠、和前述 具有Daol+的基因型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于前述试 验条件下的步骤；和(3)对将前述具有Daol+/+的基因型的小鼠、和前述具有Daol+的基因 型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于前述试验条件下所造成的 影响进行分析的步骤。本专利技术的评价方法中，前述步骤⑴有时通过Da0lV+、V_*/或+的基因型的判 定方法筛选前述具有Daol+/+的基因型的小鼠、和前述具有Daol+的基因型的小鼠。前述判 定方法有时包括以下步骤对Daol+/+,和/或+的基因型的小鼠进行个体识别的步骤；从前述经个体识别的小鼠个体中分别提取染色体DNA的步骤；对前述提取的染色体DNA中包 含第7外显子的区域进行扩增从而获得扩增DNA片段的步骤；将前述扩增DNA片段用HpaII 限制酶进行消化的步骤；以及，对前述扩增DNA片段的限制酶消化产物进行分析的步骤。本专利技术的评价方法中获得前述扩增DNA片段的步骤有时包括使用由序列号1及 2中列举的核苷酸序列构成的寡核苷酸引物进行扩增。本专利技术的评价方法中，前述具有Daol+/+的基因型的小鼠与具有Daol+的基因型 的小鼠，对于其他基因中的至少1个而言，有时等位基因的组合是相同的。本专利技术的评价方法中，前述其他基因的等位基因的组合有时包括Hr+。前述步骤(3)有时包括在前述步本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成的影响的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）准备具有Ｄａｏ１＋／＋的基因型的小鼠和具有Ｄａｏ１－／－的基因型的小鼠的步骤、（２）将所述具有Ｄａｏ１＋／＋的基因型的小鼠和所述具有Ｄａｏ１－／－的基因型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于试验条件下的步骤、和（３）对将所述具有Ｄａｏ１＋／＋的基因型的小鼠和所述具有Ｄａｏ１－／－的基因型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于所述试验条件下造成的影响进行分析的步骤。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：浜濑健司，
申请(专利权)人：国立大学法人九州大学，
类型：发明
国别省市：JP
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