本发明专利技术公开测定方法，其通过利用生理活性物质和ＬＡＬ之间的反应，而大大降低检测来自生物体的生理活性物质（例如，内毒素、β－Ｄ－葡聚糖）、或测定所述生理活性物质的浓度所需的时间。还公开利用所述测定方法的测定装置。将来自光源的入射光聚焦在样品上，递送到样品引起与作为蛋白酶级联的最终产物（即，凝固素单体）的凝固素，以及通过凝固素单体的聚集产生的极细聚集物（即，凝固素聚集物）的碰撞，从而产生散射光。通过光接收元件检测散射光。内毒素的浓度可以根据检测的散射光的初始增加率来测定。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测含有生理活性物质的样品中来自生物体的生理活性物质、或 用于测定所述生理活性物质的浓度的测定方法和测定装置，所述生理活性物质具有因与比 如内毒素或β -D-葡聚糖的LAL反应而凝胶化的性质。
技术介绍
内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁中的脂多糖，是最典型的热原。如果经 内毒素污染的输液、注射用药或血液被导入人体，则该内毒素可能诱发比如发烧和休克的 严重副作用。因此，要求保存上述药物等以使不被内毒素污染。同时，鲎变形细胞溶解物(以下，也称为“LAL”)含有由内毒素活化的丝氨酸蛋白 酶。在LAL与内毒素反应时，LAL中存在的凝固蛋白原通过取决于内毒素的量而活化的丝 氨酸蛋白酶的酶级联而被水解成凝固素，该凝固素彼此缔合形成不溶性凝胶。通过利用LAL 的特征，可以以高灵敏度来检测内毒素。同时，β-D-葡聚糖是构成真菌的细胞膜特征的多糖。例如，β-D-葡聚糖的测定 对于多种真菌引起的传染性疾病的筛选是有效的，所述真菌不仅包括一般临床实践中常见 的真菌，比如，念珠菌、曲霉和隐球菌，还包括罕见真菌。在β -D-葡聚糖的测定中，通过利用鲎变形细胞溶解物被β -D-葡聚糖凝固(凝固 形成凝胶)的特征，可以以高灵敏度检测β-D-葡聚糖。已经提出了各种方法作为用于来自生物体的生理活性物质(以下，也称为预定生 理活性物质)的检测或浓度测定的方法，所述生理活性物质可以通过鲎变形细胞溶解物来 检测，例如，内毒素或β-D-葡聚糖。方法之一是半定量的凝胶化方法，包括使要用于预 定生理活性物质的检测或浓度测定(以下，也简称为“预定生理活性物质的测定")的样品 与LAL混合所获得的混合物保持静止；经过预定时间后翻转所述容器；根据所述样品下落 的有无来判断样品是否已经凝胶化，以检查所述样品是否含有一定浓度以上的内毒素。作 为所述方法的其它实例，还给出有比浊法，该方法包括通过测定由LAL和预定生理活性物 质之间的反应所致的凝胶形成所造成的样品浊度的时程来分析样品，利用合成底物的比色 法，所述底物因酶级联而水解发色，等。在通过上述比浊法测定预定生理活性物质时，测定样品和LAL的混合物在干热灭 菌的玻璃测定池中产生。然后，从外部光学地测定混合物的凝胶化。然而，比浊法可能需要 极长时间用于LAL的凝胶化，特别是在含有低浓度的预定生理活性物质的样品中。为了解 决该问题，需要可以在短时间内测定预定生理活性物质的方法。作为该方法的实例，提出了 可以通过使用例如磁性搅拌子搅拌测定样品与LAL的混合物来形成凝胶微粒，并根据被凝 胶微粒散射的激光的强度，或根据透射过该混合物的光的强度，而在短时间内测定样品中 预定生理活性物质的存在的激光散射粒子计数方法或搅拌比浊法。已发展了上述各种方法来减少预定生理活性物质的检测时间或测定时间，或改善 测定灵敏度。然而，所有的方法都具有优点和缺点，希望在降低测定时间、提高灵敏度和消4除干扰物质方面进一步改善所述方法。引证列表 专利文献 JP 2004-061314 A JP 10-293129 A WO 2008/038329 Al。
技术实现思路
技术问题鉴于上述问题而完成了本专利技术，本专利技术的目的在于提供测定方法，其可以检测来自生 物体的生理活性物质，或可以降低浓度测定中的测定时间，以及提供利用所述方法的测定直O问题的解决本专利技术中，本专利技术的专利技术人发现，测定时间可以通过直接检测作为蛋白酶级联终产物 的凝固素本身(凝固素单体)，以及由凝固素缔合而得的极小的缔合产物(凝固素聚集物)。 所述方法的最大特征是根据散射光的增加率来检测预定生理活性物质浓度或测定浓度，所 述散射光通过用光照射用于测定预定生理活性物质的样品与LAL的混合物而引起混合物 的粒子碰撞来产生，并在光接收元件中检测。S卩，本专利技术基于专利技术人的深入研究所得的新的发现，S卩，在通过用光照射预定生理 活性物质与LAL的混合物而引起混合物中的粒子碰撞来产生散射光时，光接收元件所检测 的散射光的增加率取决于所述预定生理活性物质的浓度。本专利技术基于比浊法，利用如比色法中使用的非专门试剂，但是与比色法一样，微分 法用于判断，通过检测改变自水溶性蛋白质凝固蛋白原的疏水性凝固素单体和通过聚集某 些单体而得的低聚物的散射光，其在LAL与预定生理活性物质的凝胶化反应的极早期时间产生。更具体地，本专利技术是来自生物体的生理活性物质的测定方法，其用于通过使样品 中的生理活性物质与鲎变形细胞溶解物LAL反应，来检测所述样品中来自生物体的所述生 理活性物质或测定所述生理活性物质的浓度，包括在混合所述样品和所述LAL之后，将光发射至所述样品和所述LAL的混合物中，并获得 由该入射光从所述混合物产生的散射光强度；和根据所述散射光强度的增加率检测所述样品中的所述生理活性物质或测定所述生理 活性物质的浓度。根据这种方法，在将光发射至混合内毒素或β-D-葡聚糖与LAL而得的混合物中， 通过获得散射光强度的增加率，可以进行内毒素或β-D-葡聚糖的检测和浓度测定。因而， 与使用比浊法的情形一样，不需要等待要获得的物理量超过预定阈值，预定生理活性物质 的检测或浓度测定可以在更早的时间进行。进一步地，在本专利技术中，可以根据散射光强度的增加率中预定的急剧变化之前的 增加率来检测样品中的生理活性物质或测定生理活性物质的浓度。在此，在本专利技术中，通过散射光来检测凝固素单体和通过聚集几个单体而得的低聚物的产生，其在LAL与预定生理活性物质的凝胶化反应的极早期产生。对于该检测，散射 光被认为主要基于瑞利散射，因为被散射粒子是非常小的，且各自具有小于入射光波长的 大小。此外，随着此后粒子生长，散射光改变为主要基于米氏散射。因而，随着粒子生长，当早期的小的区域中基于瑞利散射的粒子系统转变为基于 米氏散射时，观察到散射光的增加率剧烈地变化的点。因此，在本专利技术中，检测散射光强度的增加率中预定的急剧变化之前的增加率， 即，主要基于瑞利散射的散射光的增加率。因此，有可能更精确地获得在LAL与预定生理活 性物质的凝胶化反应的极早期产生的、来自凝固素单体和聚集几个单体而得的低聚物的散 射光的增加率。结果，可以进行更精确的预定生理活性物质的检测和浓度测定。即，在本专利技术中，如上所述检测来自具有极其小的大小的粒子的弱散射光，因此入 射光的功率密度理想地尽可能高。此外，新近发现的是，当功率密度是50 mW/mm2或更高时， 可以顺利地进行检测。因此，在本专利技术中，发射到混合物中的光的功率密度理想地是50 mff/ mm2或更高。通过光源的功率或通过将入射光收束到更小的直径，可以调整所述输出密度。 进一步地，在本专利技术中，进入混合物的光的波长可以是300 nm或更高且SOOnm或 更低。即，发现基于瑞利散射的散射光的强度取决于入射光的波长，更低的波长对检测更有 利。另一方面，极短的波长可能不利地影响LAL的功能，并可能产生缺点，即比如光学设备 的材料必需被改变成适合这样的短波长。在这种情形下，使用上述范围的波长可以允许有 利的测定。进一步地，在本专利技术中，在获得散射光强度的增加率时，对预定时期内获得的多个 散射光强度进行采样和比较，确定强度的最小值或直方图的最频值作为该时期内散射光强度。如上所述，在本专利技术中，测定在LAL与预定生本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．来自生物体的生理活性物质的测定方法，其用于通过使样品中的生理活性物质与鲎变形细胞溶解物ＬＡＬ反应，来检测所述样品中的所述生理活性物质或测定所述生理活性物质的浓度，其特征在于：在混合所述样品和所述ＬＡＬ之后，将光发射至所述样品和所述ＬＡＬ的混合物中，并获得由该入射光从所述混合物产生的散射光强度；和根据所述散射光强度的增加率检测所述样品中的所述生理活性物质或测定所述生理活性物质的浓度。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：薮崎克己，
申请(专利权)人：兴和株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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