一个永生化蛋白复合体，其包括内化分子，转化多肽，和核内体释放分子；所有分子和／或多肽被有效连接到一个或多个其它多肽上，并选择性地连接到一个或多个核内化分子和端粒延长分子上。一种生产永生化细胞或延长原代细胞的生存期的方法，其包括在一定条件下，将本发明专利技术的永生化蛋白复合体与靶细胞接触，并经过一段有效时间，蛋白复合体被内化，转化多肽被释放，并允许转化多肽延长细胞的生存期，和／或克服细胞停滞。而且本发明专利技术也提供了编码蛋白复合体的永生化多核苷酸，携带表达载体和多核苷酸的杂交载体，用杂交载体转化的细胞，表达蛋白复合体的细胞，以及细胞永生化试剂盒，其包括蛋白复合体，和／或编码蛋白的多核苷酸，和／或携带多核苷酸的杂交表达载体，以及如何实施永生化细胞的说明书。本发明专利技术也提供了细胞和组织移植物，其包括细胞，永生化细胞和组织的各种相应用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及永生化细胞，及其在实验研究、治疗及检测方面的用途。本专利技术提供了 一种采用蛋白而非核酸的永生化细胞的新方法。
技术介绍
制备转化细胞的传统方法是利用E6/E7病毒致癌基因的DNA或RNA。此后，可将所 述基因转染入靶细胞。或者，将所述基因克隆进入病毒载体，所述杂交载体通过病毒感染转 移到靶细胞内。多数情况下，为了使其后的工作步骤及筛选更加便捷，所述基因转移载体上 有一个耐药基因作为标记。一般地，使用耐药基因标记后，细胞能在基因转移后立即被筛选 出来。或者，可允许正常细胞死亡，分析存活细胞，确定特性以供后用。目前迫切需要一种大量制备细胞的方法，此方法不含有或最低程度含有的癌细胞 和转化细胞不必要的特性。而且也明确地需要一种细胞系，其能够很容易地繁衍、维持培 养、并有能力分化、基因变异、稳定代谢，以及对细胞外的试剂有一致反应。对于诸如细胞治 疗和组织工程等临床应用，能够将源自各种器官的细胞无需基因修饰而大量增殖是非常重 要的。
技术实现思路
为了实施本专利技术，本专利技术提供了一种永生化蛋白复合体，其包括内化分子、转化多 肽，及核内体释放分子；在一个优选实施方案中，所有的分子和/或多肽可以被有效连接到 一个或多个其它多肽上。在另一个优选实施方案中，内化作用是核内体介导的。在另一个 优选实施方案中，所述永生化蛋白复合体进一步包括核内化分子和端粒延长分子。在进一 步实施方案中，内化功能和核内体释放功能由同一分子完成，因此内化分子和核内体释放 分子是相同的，例如使用病毒颗粒和病毒衣壳蛋白的情况下。本专利技术同样包括编码永生化蛋白复合体的永生化多核苷酸；携带表达载体和永生 化蛋白复合体的多核苷酸的杂交载体；通过杂交载体被转化的细胞；表达永生化蛋白复合 体的细胞；含有永生化蛋白复合体的组合物；和细胞永生化试剂盒，其包括永生化蛋白复 合体，和/或编码蛋白复合体的多核苷酸，和/或携带多核苷酸的杂交表达载体，及如何实 施永生化细胞方法的说明书。另外，本专利技术的另一方面涉及一种制备永生化细胞或延长原代细胞存活期的方 法，其包括将本专利技术所述的永生化蛋白复合体与靶细胞在一定条件下接触，经过一段有效 时间，蛋白复合体被内化，转化多肽被释放；并允许转化多肽延长细胞的存活期，和/或克 服细胞增长停滞，和/或克服细胞衰老，和/或阻止细胞分化。在一个优选执行方案中，此 方法进一步包括从细胞培养基中移除永生化蛋白复合体，以逆转永生化效果，获得具有正 常表型及能够经历完全分化的细胞。本专利技术也涉及根据以上方法处理过的细胞和组织。附图说明图1表示根据本专利技术的一个实施方案所进行的E6融合蛋白复合体诱导表达的聚 丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。泳道M是低分子量标记；泳道1包含样本未采用IPTG诱 导，37°C培养8小时；泳道2包含样本采用0. 5mM IPTG诱导，37°C培养4小时。图2表示根据本专利技术的同一实施方案所进行的E6融合蛋白复合体的SDSD-PAGE 和蛋白免疫印迹。泳道1是考马斯蓝染色的E6融合蛋白复合体；泳道2是用抗E6抗体标 记的所述融合蛋白复合体的蛋白免疫印迹；泳道M是低分子量标记。图3表示根据本专利技术的另一个实施方案所诱导的E7融合蛋白复合体的SDS-PAGE。 泳道M是低分子量标记；泳道1是采用0. 5mMIPTG诱导，37°C培养4小时后的上清；泳道2 是采用0. 5mM IPTG诱导，25°C培养5小时后的上清；泳道3是未采用IPTG诱导，37°C培养 4小时后的上清。图4表示根据本专利技术的同一个实施方案从M-IDA柱洗脱后的E7融合蛋白复合 体。泳道1是洗脱部分；泳道M是蛋白标记。图5表示根据本专利技术的同一实施方案采用Ni树脂分离E7和标记。泳道M是分子 量标记；泳道1是纯化柱洗脱部分；泳道2是采用HPV 16E7特异性抗体标记后的蛋白免疫 印迹。图6表示根据本专利技术的另一个实施方案，角化细胞对E6和E7融合蛋白中的HPV 16 的应答。(a) 0. 75 μ g/mL E6 融合蛋白 +0. 25 μ g/mL E7 融合蛋白；(b) 1 μ g/mL E6 融合 蛋白 +0. 33 μ g/mL E7 融合蛋白；(c) 0. 67 至 2 μ g/mL E7 融合蛋白；(d) > 2 μ g/mL E7 融合 蛋白；(e) 2至6 μ g/mL E6融合蛋白；(f) > 6μ g/mL E6融合蛋白；(g)对照。从以下的讨论中可知，本专利技术的其它目标，优势及特征对于本领域技术人员来说 是显而易见的。具体实施例方式本专利技术产生于专利技术人的一个愿望，期望改善现有技术中涉及原代细胞和恶性转化 细胞系在生物医学研究中的应用。在专利技术人本人的研究中，他们遇到了关于使用非永生化 的原代细胞的问题，原代细胞必须要从新鲜的尸体中重新获得并很难维持培养。专利技术人也 非常熟悉在实验室里采用恶性转化细胞系的缺点，即它们缺乏分化能力，而且容易基因突 变，异常代谢，而且经常表现出对细胞外试剂不正常的应答。在尝试克服上述缺点的过程中，专利技术人发现，能够利用用于细胞永生化过程的蛋 白大量并重复繁殖具有所需要特性的细胞。本方法适用于体内、体外及原位应用。示例性应用包括，但不限于，生产培养中被 延长生存期的细胞，扩展干细胞和祖细胞的培养和移植，扩展皮肤或其它上皮细胞的培养 和移植，扩展间质细胞的培养和移植，扩展软骨细胞和骨细胞的培养和移植。被本专利技术方法 延长生存期的示例性干细胞和祖细胞包括神经元细胞、造血细胞、上皮细胞、胰腺细胞、肝 细胞、软骨细胞，骨细胞以及其它细胞性干细胞和祖细胞。本方法也适用于创伤和烧伤治 疗，而且一般更多用于组织修复应用和整容应用。本专利技术同样适用于延长通常用于研究目 的正常细胞或组织的培养存活期，而且一方面也适用于用来分泌有治疗效果和其它有商业 意义的蛋白和产品的正常细胞。基于蛋白的细胞永牛化方法专利技术人正在提供一个用于生产细胞系过程，此细胞系适用于生物研究及检测从他 们的实验工作中产生的外源和内源试剂。在本专利技术所述过程中，基因可以用重组方法被表 达成融合蛋白。以此获得的融合蛋白以蛋白复合体的形式存在，其包括，永生化或转化多 肽、内化或易位的多肽以及核内体释放信号。蛋白复合体中可以选择性地加入细胞表面受 体结合区域，以辅助细胞内化所述蛋白复合体。蛋白复合体也可以被生产为融合蛋白。融 合蛋白可以在转录后产生，例如，通过向永生化蛋白体中化学添加核内体释放信号，以及有 选择性地添加受体结合区域。一旦获得，蛋白复合体或融合蛋白即可自发的被内化入细胞， 所述内化是通过受体内吞作用选择性的与细胞表面受体结合进行的。所述内化作用也可选 择性的为核内体介导的。一旦进入细胞内部，蛋白复合体或融合蛋白就进入核内体，在核内 体中，永生化多肽与蛋白的其余部分分离或者继续与蛋白结合。由于核内体释放信号分解 了核内体，其释放出永生化蛋白，然后所述永生化蛋白可以在宿主细胞上自由发挥其永生 化或促进生长的作用。本专利技术是一个对延长细胞的存活期，及获得永生化细胞系的有效过程，所述过程 是利用蛋白或蛋白复合体而不是DNA或RNA编码永生化基因，以在培养中或在体内来永生 化或延长细胞的存活期。尽管提供了一个特定例，所述方法同样适用于其它永生化多肽及 其它类型的细本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种永生化蛋白复合体，包括：至少一种内化分子；至少一种转化多肽；至少一种核内体释放分子；并且其中所述至少一种分子或多肽被有效连接到至少一种所述分子或多肽上。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱志强，
申请(专利权)人：朱志强，
类型：发明
国别省市：HK
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