新的噬菌体粘附蛋白制造技术

本发明专利技术涉及结合革兰氏阴性细菌的Ｏ－抗原的噬菌体粘附蛋白，其缺乏结合噬菌体和水解脂多糖的能力。本发明专利技术还涉及核酸分子，其包括编码本发明专利技术蛋白质的序列。另外，本发明专利技术涉及用来产生本发明专利技术噬菌体粘附蛋白的方法。本发明专利技术还涉及所述蛋白质的用途以及检测、纯化和富集细菌的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种结合革兰氏阴性细菌O-抗原的噬菌体粘附蛋白，其缺少结合噬 菌体和水解脂多糖的能力。本专利技术还涉及一种核酸分子其包括编码本专利技术蛋白质的序列。 此外，本专利技术涉及产生本专利技术的噬菌体粘附蛋白的方法。本专利技术还涉及所述蛋白质的用途 以及检测、纯化和富集细菌的方法。
技术介绍
噬菌体是高度特异的病毒，其仅侵染细菌。侵染时，噬菌体利用粘着结构来与它们 的细菌宿主结合。噬菌体的特异性由其自身的一系列蛋白质来定义，所述一系列的蛋白质 对于与目标细胞的结合是重要的。噬菌体-细菌体系在自然界中已经进化了相当长的时 间，因此噬菌体以高特异性的方式识别它们的宿主细菌，并且具有高水平的结合亲和性。噬菌体特异地结合到细菌上是由于噬菌体粘附蛋白所引起的。噬菌体粘附蛋白特 异地结合到位于细菌表面的不同的一群受体上。这些细菌表面受体可以为脂多糖成分，特 别是革兰氏阴性细菌中的0-抗原或LPS核以及革兰氏阴性细菌表面的是荚膜多糖的K-抗 原，革兰氏阳性细菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸质成分，细菌的膜结合型蛋白，特殊细 菌的突起物例如鞭毛、菌毛或伞部，或胞外成分例如被膜或粘液层，糖类，多糖基质，表面蛋 白质层或细胞壁结合型蛋白。一些噬菌体粘附蛋白有酶活性，例如0-抗原或K-抗原结合 蛋白，而另外一些没有酶活性，例如噬菌体粘附蛋白结合膜结合型细菌蛋白质。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的一部分，其由脂质Α、核心区和0-抗原形 成。0-抗原是细菌脂多糖最外表面暴露的部分，其由寡糖的重复单元形成，脂质A为锚定在 外膜或革兰氏阴性细菌内的区域。与脂质A和核心区相比，0-抗原是细菌脂多糖中变化最 多的部分。0-抗原结构中的巨大变化(几百种变体)提供了将对细菌的检测深入到血清群 (serogroup)水平的一种根据。传统的细菌检测利用抗体来区分接近地相关菌株。例如， 目前在本领域中，利用不同的抗血清已经将沙门氏菌属分为具有67种不同的0-抗原的46 种血清群(一些血清群被定义为多于一种的0-抗原的组合)。大肠杆菌数据库(EC0DAB; Stenutz et al. ,2006, FEMS Microbiol. Rev. 30,382-403)列出了 178 种不同的 0-抗原。 通常通过利用大肠杆菌的抗血清的经典凝集方法来鉴定大肠杆菌的血清型。天然存在的噬 菌体利用细菌表面上的不同的受体来吸附到细菌细胞上。噬菌体粘附蛋白包括至少两个功能域，其中N-端区域与噬菌体结合，C-端区域与 细菌表面的受体结合。当噬菌体粘附蛋白有酶活性，例如水解细菌的0-抗原或K-抗原时， 该C-端区域也包含活性位点。然而，噬菌体粘附蛋白常包括多个域的模块式排列，经常可 以观察到不同功能部分的同源性有不同。在结合之后，结合0-抗原的噬菌体粘附蛋白显示出水解脂多糖0-抗原的水解活 性。所述脂多糖的水解是噬菌体侵染时多糖层侵入过程中的一部分。涉及噬菌体侵染的另 一个过程是所谓的“表面行走(surface walk)”过程。正在侵染的细菌进行所述的“表面 行走”以找到适合于DNA注入的位于细菌表面的位点。上述两个生物学过程(多糖侵入和 “表面行走”)均包括噬菌体的反复结合和释放。因此，所述噬菌体粘附蛋白和细菌表面的0-抗原的结合是由所述噬菌体粘附蛋白的水解活性所引起的可逆的结合。高水平的结合亲和性使得噬菌体粘附蛋白可以用作“生物吸附剂”，实现无论是在 自然界中存在的复杂环境中，还是在生物学样品例如食品中均可以特异性地结合细菌。到目前为止，已经有不同的针对噬菌体粘附蛋白用作生物吸附剂的实际应用，例 如检测和鉴定单一菌株或细菌群，或者纯化细菌细胞和细胞成分。快速和准确的检测细菌是用来诊断和治疗人类和动物中的细菌传染，以及启动预 防措施的第一主要步骤。另外，所述检测对于控制原料和已加工食品的卫生和质量是有用 的，并且对于监控饮用水、工业用水和公共浴室用水的卫生和质量方面是有用的。此外，所 述检测对于过程监控和最优化，以及环境分析中的质量控制也是有用的。EP1198713A2和EP1356080A1描述了用于检测和鉴定单一菌株和细菌群的方法， 其中将整个噬菌体或噬菌体蛋白质偶联在支撑物上。在对偶联的噬菌体或噬菌体蛋白质与 测试样品进行温育后，可以检测出结合到噬菌体或噬菌体蛋白质上的样品中的细菌。当用在微生物检测体系时，在细菌检测和鉴定方面，噬菌体粘附蛋白提供了大量 优于其它生物吸附剂(例如抗体)的优点，例如优异的特异性和出众的结合性。特异性越 高越可以降低假阳性和假阴性的数量，并且目标结合性越好可以提供的信号比噪音的比值 越好。另外，噬菌体粘附蛋白可以被固定于任何表面并且可以容易地与其它分子(例如荧 光标记)偶联。已经证实了噬菌体粘附蛋白在多种不同的应用中可以提供良好的表现，即 使是面对要求最为严格和复杂的食品领域。此外，细菌细胞和细胞成分的纯化对于几乎任何后续加工、分析或细胞成分的分 离均是非常重要的。EP1399551A2描述了用于纯化细菌细胞和细胞成分的方法，其中含有细 菌细胞或细胞成分的样品与整个噬菌体或噬菌体蛋白质接触。然后，所述细菌细胞或细胞 成分以及噬菌体或噬菌体蛋白质的样品与固体支撑物一起温育。温育之后，固体支撑物可 以从样品中分离，从而也将细菌细胞或细胞成分分离，该细菌细胞或细胞成分结合在噬菌 体或噬菌体蛋白质上，而噬菌体或噬菌体蛋白质结合在固体支撑物上。如EP1399551A2所述借助噬菌体或噬菌体蛋白质对细菌细胞和细胞成分进行纯 化，除了其它优点之外，该方法还可以自动地进行，并且因此可以整合到自动分析或分离方 法(例如质粒的纯化)中。然而，在天然存在的噬菌体或噬菌体蛋白质以及细菌之间存在结合平衡，这归因 于由噬菌体粘附蛋白的水解活性而产生的噬菌体粘附蛋白的可逆的结合。这个效果降低了 这类基于噬菌体的细菌分析方法的灵敏度。在本领域中已知的基于噬菌体的细菌分析方法中，噬菌体粘附蛋白通常是非常大 的蛋白，由多于1000个氨基酸的多肽链构成，其中所述噬菌体粘附蛋白由提供不同功能的 数个结构部分组成。噬菌体粘附蛋白的这种大小和数个结构部分的特点导致难以表达、纯 化，分离并且保存所述的噬菌体粘附蛋白。噬菌体粘附蛋白的模块区域排列还具有对蛋白 酶解敏感的风险，蛋白酶可以在噬菌体粘附蛋白的不同功能模块之间降解。这样的蛋白酶 降解引起噬菌体粘附蛋白性质的变化，并伴有蛋白质活性的丧失。因此，本专利技术的目的在于提供噬菌体粘附蛋白，其用于更有效地结合、富集、移除、 捕获和检测革兰氏阴性细菌。在权利要求书中限定的专利技术主题解决了上述目的。附图说明下面的附图用来说明本专利技术。图1为示出大肠杆菌0111 :B4的LPS的化学结构的示意图。标记出代表LPS的三 个部分，即脂质A、核心区和0-抗原，η =重复单元的数量；H印=L-甘油-D-甘露糖-庚 糖；Gal =半乳糖；Glc =葡萄糖；KDO = 2-酮基-3-脱氧辛酸；NGa = N-乙酰基-半乳糖 胺；NGc = N-乙酰基葡糖胺。图2示出了 P22尾部刺突(tail spike)和Det7尾部刺突(SBPl)的氨基酸序列的 比对。相同的氨基酸残基用“*”表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用“”表示，不太密 切相关的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性结合革兰氏阴性细菌Ｏ－抗原的噬菌体粘附蛋白，其中所述噬菌体粘附蛋白与其野生型相比缺少结合噬菌体和水解脂多糖的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：曼弗雷德·比布尔，
申请(专利权)人：拜奥默里克斯公司，
类型：发明
国别省市：FR