用于生物化学反应的冷冻干燥的组合物制造技术

技术编号:7137467 阅读:188 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
蜜三糖用作冷冻干燥的组合物所使用的玻璃形成用试剂的用途,该组合物预期用于进行化学或生物化学反应如PCR。因此,例如,提供用于进行化学或生物化学反应的组合物,该组合物呈现冷冻干燥的形式并且包括(i)包括至少一些为进行该化学或生物化学反应所必需的化学或生物化学试剂的试剂组,和(ii)蜜三糖。包括这些组合物的试剂盒以及使用它们的方法构成了本发明专利技术的再一个方面。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物化学反应的冷冻干燥的组合物本专利技术涉及用于化学或生物化学反应如聚合酶链式反应中的包括试验试剂的组 合物和涉及制备这些组合物的方法。冷冻干燥是材料,尤其生物材料如细胞和蛋白质,的长期储存的常用方法。然而, 包括蛋白质在内的许多材料在这一方法中是不稳定的。该问题一定程度上通过糖如二糖如 蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖在用于冷冻干燥中的配制剂中的添加来解决的。这些糖用作玻 璃形成用的试剂,而且和看来似乎在冷冻干燥过程中保护蛋白质。已经表明这归因于蛋白 质与二糖之间的经由氢键所进行的直接相互作用,该氢键作用对于稳定效果是必要的,因 为这会防止在冷冻干燥过程中蛋白质的构象变化。这意味着冷冻干燥现在可以用来稳定包括蛋白质如酶和细胞在内的复杂反应体 系,尤其为了储存目的。然而,一般来说,另外的稳定剂如聚合物(包括聚合化合物,如聚乙 二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和/或多糖(如Ficoll或Dextran))用来维持酶活 性。这些聚合物通常是有助于形成均勻的饼块结构的饼块稳定化赋形剂。这通过允许形成 均勻的基质使得在升华过程中实现水的有效离开而有助于该干燥过程。它们因此影响最终 饼块结构。此外,在例如化学或生物化学反应中常常一起使用的一些试剂的冷冻干燥的混合 物的制备中引起复杂化。例如,广泛使用的聚合酶链式反应(PCR)(包括逆转录酶聚合酶 链式反应(RT-PCR))采用一定范围的标准试剂,包括盐如氯化镁(MgCl2)和氯化钾,聚合 酶酶如Taq聚合酶,缓冲剂如Tris-HCl,和为核酸的扩增所需要的核苷酸。此类制剂例如 作为“即可使用的 PCR 珠粒(ready-to-go PCR beads),,从 Amersham Biosciences (UK) / Pharmacia 1 !!^一般而言,这些是通过冷冻干燥方法制备的,它是在玻璃形成用试剂和针对所形 成的结构的稳定剂以及任选的填料的存在下进行的(参见例如US专利No. 5,250,429,US 专利No. 5,763,157和ΕΡ-0726310)。海藻糖尤其已经用于PCR混合物中以协助稳定化和作 为PCR增强剂用于非冷冻干燥的配制剂中。然而,在这些反应混合物中用作玻璃形成用试 剂和稳定剂的试剂的选择中应当注意确保它们不会干涉或过度地抑制其中所述组合物需 要参与的化学或生物化学反应。尽管如此,当需要时,此类珠粒为实验室进行它们的选择的PCR反应提供方便的 和容易可行的手段。一般,使PCR适用于特殊靶向物(target)的特定试剂,如为了例如与 实时PCR相关联使用所需要的引物(primer)和任何探针,连同芯珠粒(core bead) 一道在 反应准备好的“现场”被添加进去。然而,在很多情况下,尤其在诊断领域中,这些靶向物(target)在许多情况下是 相同的,并且探针和引物在珠粒中的包含(这样该珠粒变成测定特异性的)是便于使用所 希望的。通过以这种方法添加另外的反应组分,稳定性问题增大,因为为了维持稳定形式 将需要更多的组分。由于测定的性质变得更复杂,在反应中的其它组分如玻璃形成用试剂 和稳定剂将干涉或抑制反应的风险会增大。此外,所述其它反应组分可以包括可以包含相对敏感的化学部分,如标记和尤其 光学标记(如荧光标记或染料),的试剂。这些尤其用于“实时”进行测定。敏感性部分常 常结合于低聚核苷酸,后者可以被设计用作探针或标记的引物。这些将在PCR的过程中杂 交(hybridise)以扩增核酸。在PCR的过程中探针的历程和在来自于该标记的相关信号上 的变化以各种方式用于监测PCR的进展。然而,这样的部分的存在能够加剧与组合物的形成相关的问题,这是因为在组合 物中的稳定化用添加剂可能导致信号发出功能(尤其来自荧光标记)的减少或抑制。蜜三糖以前已经在细胞或蛋白质以及药物制剂的冷冻干燥中用作玻璃形成用试 剂(Kajuwara et al. Pharmaceutical Research Vol 16,9 1999),但是迄今还没有用于复 杂化学或生物化学反应混合物的冷冻干燥中。在此类混合物中,如以上所述,包括玻璃形成 用试剂的全部组分必须小心地选择,这样它们产生稳定的和持久的干燥的组合物,并且不 会以任何有害方式抑制或参与后续的化学反应。W02006/119280描述了用于反应如PCR中 的冻干团粒,它包括防冻剂。各种各样的防冻剂已列于该参考文献中,其中包括蜜三糖与一 种或多种“多元醇类”的混合物,该多元醇类似乎在这一背景下在它指糖醇而不是任何多元 醇的意义上使用(因为它有时候就是),因为提供的例子是甘露糖醇或山梨糖醇。然而仅仅 海藻糖被表明是可使用的。申请人:已经发现了手段来提供用于进行化学或生物化学反应的改进型冷冻干燥 组合物,其中包括采用荧光标记的那些组合物。根据本专利技术,提供了蜜三糖作为冷冻干燥组合物的玻璃形成用试剂的用途,该组 合物预期用于进行化学或生物化学反应如聚合酶链式反应(PCR)或逆转录酶(RT) PCR。申 请人已经发现,蜜三糖可用作这些组合物的有效的玻璃形成用试剂和稳定剂并且与化学或 生物化学反应如PCR相容。该蜜三糖不适宜与单体多元醇类或糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇 混合,而且这些附加化合物在本专利技术的组合物中也不需要。当以这种方式使用时,蜜三糖不 会抑制反应,甚至对于复杂的‘实时’ PCR反应而言。因此,附加的稳定剂的使用可以避免, 因此例如荧光信号发出系统的抑制被降低。因此本专利技术提供用于进行化学或生物化学反应的组合物,该组合物呈现冷冻干燥 的形式并包括(i)包括至少一些为进行实时化学或生物化学反应所需要的化学或生物化 学试剂的一组试剂,和(ii)蜜三糖。蜜三糖(它可以呈现蜜三糖五水合物形式)用作与化学或生物化学反应相容的有 效的玻璃形成用试剂。合适的冷冻干燥的组合物将包括用于化学或生物化学反应中的那 些,它们采用荧光标记或部分作为信号发出或指示手段。此外,蜜三糖已经发现产生比普通的糖如海藻糖更稳定的饼块。这可以归因于以 下事实它也能够用作干燥剂。与含有海藻糖的组合物相比,通过冷冻干燥蜜三糖组合物所 获得的饼块可具有更好的结构和处置(handling)性能。在一些情况下,用蜜三糖可获得的 结果优于用含有海藻糖的组合物所获得的那些结果,如下面所说明。蜜三糖必须以玻璃形成用量存在于组合物中。然而,它不应该以如下大的量存在 通过水的添加实现组合物的重新组成而生产出用于化学或生物化学反应中的“最终组合 物”时,它以抑制或以另外方式限制反应的量存在。它适宜以一种用量存在于组合物中,该 用量使得它占最终反应组合物的约l_10%m/v或l-10%w/w,例如2. 5_10%m/v或2. 5_10%w/w和适宜约5%m/v或5%w/w,当配制好准备用于进行化学或生物化学反应时。下面将更详细 地讨论,为干燥所制备的组合物(即"饼块组合物“)可以适宜是更稀的,因此在最初制备 的组合物中蜜三糖的重量百分数(按体积)可以相应地降低。下面提供的实施例中,配制 剂是以各试剂的体积的列表所给出的(在给定的浓度或比活性下)。当该体积是指“饼块 体积”时,这表示用于该冷冻干燥过程中的试剂的体积。当该体积称为反应或最终体积时, 这是在PCR/RT-PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于进行化学或生物化学反应的组合物,所述组合物呈现冷冻干燥的形式并包括(i)试剂组,所述试剂组包括至少一些进行所述化学或生物化学反应所必需的化学或生物化学试剂,和(ii)蜜三糖;  其中所述组合物不含有单体型糖醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:F弗兰克斯
申请(专利权)人:恩尼格马诊断有限公司
类型:发明
国别省市:GB

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