本发明专利技术提供一种使用色谱法的提纯或浓缩凝固ＦＶＩＩＩ的方法，包括以下步骤：在具有高离子强度的水性溶液中提供含有ＦＶＩＩＩ的级分；使所述含有ＦＶＩＩＩ的级分与多模态树脂接触；任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附了ＦＶＩＩＩ的多模态树脂；用水性洗脱缓冲液洗脱含有ＦＶＩＩＩ的级分，所述洗脱缓冲液包含至少一种在ｐＨ值６至８的条件下带正电的氨基酸；以及任选地收集提纯形式的或浓缩形式的含有ＦＶＩＩＩ的级分。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提纯凝固因子Vl I I的方法本专利技术涉及提纯凝固因子VIII (简称FVIII)的方法和通过本专利技术的方法获得的 含有FVIII的级分。
技术介绍
血友病是一种遗传性疾病，其降低人体控制血液凝结或凝固的能力。在其最普通 的形式，血友病A中，凝固FVIII是缺失的，血友病A在5，000-10, 000名男婴中约出现1 例。FVIII蛋白质是血液凝固中具有多功能性质的重要协同因子。可以用FVIII的血浆 源性浓缩液或用重组产生的FVIII来治疗FVIII的缺失。使用FVIII浓缩液的治疗已经 使血友病患者过上了正常的生活。在历史上，已经使用源自人类血浆的FVIII来治疗血友 病A。在血浆中，在正常条件下，FVIII分子通常与其协同因子、血管假性血友病因子(von Willebrandt factor) (vfff)有关，所述血管假性血友病因子使不同退化形式的FVIII分子 稳定。血浆源性FVIII产品以不同的纯度出现在市场上，并且存在或多或少量的vWf。通 常，具有低含量vWf的产品含有附加的人血白蛋白和/或其他稳定剂(包括增加的盐浓度 以使FVIII分子稳定)。提纯FVIII的方法通常是不同沉淀法与色谱法步骤的组合，所述沉 淀法例如冷沉淀法、氢氧化铝沉淀法等，所述色谱法主要例如离子交换步骤、亲和过滤步骤 和凝胶过滤步骤。为了改善FVIII产品，使用亲合色谱法，亲合色谱法有效地去除污染物达到高度 的FVIII纯度，包括同时降低vWf的可能性(Farrugia等，Biotechnology and plasma fractionation industry ；The impact of advances in the production of coagulation FVIII. Biotechnology, Vol. 3，No. 1，1993年2月)。免疫亲和色谱法的缺点在于其比较昂 贵以及用作亲和配体的单克隆抗体源自动物。在20世纪80年代中期，发生了与血浆源性FVIII产品有关的一些病毒传染。即 使通过进行特定的病毒降低步骤解决了这一问题，这依然是开发重组FVIII产品(rFVIII) 的出发点。在20世纪90年代，第一个rFVIII产品上市，到现在有三种不同的具有高纯度 的(全部不含有vWf) rFVIII产品(两种全长分子和一种B-结构域剔除分子，在所述B-结 构域剔除分子中FVIII分子的非活性部分被去除，从而增加宿主细胞的生产力(Eriksson 等，The manufacturing process for B-domain deleted recombinant FVIII. Seminars in Hematology, Vol 38，No 2，Suppl. 4(April)，20001 :24-31 页))。用于提纯rFVIII的提纯方法都是不同色谱技术的组合(参见Miattacharyya等， Review article ；Recombinant FVIII for Haemophilia “An overview of production technologies”· CRIPS Vol. 4，No. 3，2003年6月_9月)。一种方法是已知的免疫亲和技术 (虽然有解决这一问题的产品，例如使用肽亲合力(Kelly等，Development md validation of an affinity chromatography step using a peptide ligand for cGMP production of FVIII)或像用于血浆FVIII —样使用的酵母源性抗体片段(VIIISelect FVIII亲和树 脂-GE Health care公司，商品目录号17-5450正在进入市场)。由于在所有rFVIII产品中都不含有vWf，因此必须采取特定的措施以使FVIII分 子稳定而不丧失活性(聚集、蛋白酶、表面吸附等)。在这些产品中的一个中，加入了螯合剂 (EDTA等)从而保护FVIII防止金属蛋白酶的退化(US-A-5, 831,026).为了增加rFVIII分 子的稳定性，已经采取的方法有加入白蛋白、抑肽酶、胰岛素或甚至使rFVIII与vWf共表达 (并在提纯周期后阶段将其去除)(参见Bhattacharyya等，Review article ；Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies，，· CRIPS Vol. 4, No. 3，2003 年 7 月-9 月)。在EP-A-I 707 634中描述了另一种方法(保持没有哺乳动物添加剂和螯 合剂的方法)，其中增加的盐量的组合对rFVIII产品的稳定性和高回收率做出贡献 (Wang 等，Coagulation FVIII, structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003)，1-15.)。然而，这一技术具有特定的缺点。例如，较高的盐含 量使得其不适于在不稀释的情况下直接用离子交换器处理(并可能不稳定化，Parti等，In vitro stability of recombinant FVIII. Haemophilia(2000),6, 513-522. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87，No. 3，2004 年 8 月 5 日·)。W0-A-2009/007451公开了一种使用混合模态或多模态树脂的FVIII提纯方法。该 提纯方法基于使FVIII蛋白质与含有配体的多模态或混合模态树脂接触，并用洗脱缓冲液 洗脱所述FVIII蛋白质，所述配体包含疏水部分和带负电部分，所述洗脱缓冲液含有至少 1.5M盐和至少40% (W/V)的乙二醇、丙二醇或其混合物以及钙离子。EP-A-1707634公开了一种重组制备的蛋白质的分离方法，即通过各种方法，例如 免疫亲和色谱法、亲和色谱法、蛋白质沉淀法、缓冲液交换法、离子交换色谱法、疏水作用色 谱法、混合模态疏水/离子交换色谱介质、螯合色谱法、糖亲和类凝集素或肝素亲和色谱 法、尺寸排除色谱法、电泳、渗析，不同的沉淀剂，例如乙聚二醇、硫酸铵、乙醇，羟基磷灰石 吸附、过滤膜吸附、与磁性颗粒结合的配体等。然而，其确定特殊的色谱提纯步骤。W0-A-2005-08M83公开了一种从液体中的一种或多种杂质中提纯抗体的方法，所 述方法包括使所述液体与由支撑物构成的第一色谱树脂接触，在所述支撑物上固定有多模 态配体从而使抗体吸附在树脂上，其中每种多模态配体包含至少一个阳离子交换基团和至 少一个芳香族或杂芳族环体系。加入洗脱液以使抗体从树脂中释放出来，并使洗出液与第 二色谱树脂接触。TO-A-2005/121163公开了一种从蛋白质溶液中分离一种或多种蛋白质的方法。所 述方法包括提供蛋白质溶液的步骤，所述蛋白质溶液含有一种或多种特定蛋白质，并且具 有预定的PH值和预定的离子强度或电导率，
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于通过提供新方法来避本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用色谱法提纯或浓缩凝固ＦⅧ的方法，包括以下步骤： －在具有高离子强度的水溶液中提供含有ＦⅧ的级分； －使所述含有ＦⅧ的级分与多模态树脂接触； －任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附了ＦⅧ的多模态树脂； －用水性洗脱缓冲液洗脱含有ＦⅧ的级分，所述水性洗脱缓冲液包含至少一种在ｐＨ值６至８的条件下带正电的氨基酸；以及 －任选地收集提纯形式的或浓缩形式的含有ＦⅧ的级分。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：卡里恩·博里瓦尔，
申请(专利权)人：奥克塔法马股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH
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