本发明专利技术提供用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀虫活性的组合物和方法。本发明专利技术提供包含δ－内毒素多肽的编码序列的组合物。该编码序列可用于在植物和细菌中转化和表达的ＤＮＡ构建体和表达盒中。该组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体而言，本发明专利技术提供分离的δ－内毒素核酸分子。此外，本发明专利技术涵盖对应于多核苷酸的氨基酸序列和特异性结合那些氨基酸序列的抗体。具体而言，本发明专利技术提供分离的核酸分子，其包含编码ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－１２１和１３３－１４１中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－６０、１２４－１３２和１４２－２８３中所示的核苷酸序列，及其变体和片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分子生物学领域。所提供的是编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和 编码它们的核酸序列用于制备杀虫制剂和用于产生转基因抗害虫植物。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是革兰氏阳性的产芽孢土壤细菌，其 特征在于其产生晶状包含体的能力，该晶状包含体特异性地对某些目和种的昆虫有毒，但 对植物和其他非靶标生物体无害。由于此原因，包含苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀虫蛋 白的组合物可以用作环境可接受的杀虫剂来控制农业昆虫害虫或各种人或动物疾病的昆 虫媒介。源自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白质(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目 (L印idopteran)、双翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼虫的有效杀虫活性。这些 蛋白质还已显示针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、 食毛目(Mallophaga)和蜱螨亚纲(Acari)害虫目，以及其他无脊椎动物目如线形动物门 (Nemathelminthes)、扁形云力物(Platyhelminthes)禾口 肉鞭虫门(Sarcomastigorphora) 的活性(Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y.中的 Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree)。最初主要根据这些蛋白质 的杀虫活性将它们分类为CryI至CryV。主要的种类是鳞翅目(L印idoptera)特异的(I)、 鳞翅目和双翅目(Diptera)特异的(II)、鞘翅目(Coleoptera)特异的(III)、双翅目特异 的(IV)和线虫类特异的(V)和(VI)。进一步将这些蛋白质分类进入亚家族；为各家族内 更高度相关的蛋白质指定各字母如CrylA、CrylB、CrylC等。各分部内还更接近地相关的蛋 白质命名为如CrylCl、CrylC2等。最近描述了基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶特异性的Cry基因的新命名法 (Crickmore 等(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813)。在此新分类中，为各毒素指 定合并了初级等级(阿拉伯数字)、二级等级(大写字母)、三级等级(小写字母)和四级 等级(另一个阿拉伯数字)的唯一的名称。在此新分类中，在初级等级中已将罗马数字调 换为阿拉伯数字。序列同一性低于45%的蛋白质具有不同的初级等级，二级等级和三级等 级的标准分别是78%和95%。晶体蛋白质直到被摄入并在昆虫中肠中溶解时才显示杀虫活性。昆虫消化道中 的蛋白酶将摄入的前毒素水解为活性毒性分子。(H6fte和Whiteley (1989)Microbiol. Rev. 53 :242-255) 0该毒素与靶标幼虫中肠中的顶刷状缘受体结合并插入顶膜(apical membrane)产生离子通道或管孔，导致幼虫死亡。δ -内毒素一般具有5个保守序列域(sequence domain)和3个保守结构域(见 例如 de Maagd 等 Q001)Trends Genetics 17:193-199)。第一个保守结构域由 7 个 α 螺 旋组成并涉及膜插入和管孔形成。结构域II由以希腊钥匙构型排列的3个β片层组成， 而结构域III由”薄卷饼”型的2个反平行β片层组成(de Maagd等，2001，上文)。结构域II和III涉及受体识别和结合，因此认为它们是毒素特异性决定子。基于苏云金芽孢杆菌的杀虫剂的密集使用已经在菜蛾(Plutella xylostella)田 间群体中引起了抗性(Ferr6 和 Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47 :501-533) 最常见 的抗性机制是毒素与其一种或多种特异性中肠受体结合的减弱。这还可以赋予对共用同一 受体的其他毒素的交叉抗性(Ferr6和Van Rie (2002) )0专利技术概述本专利技术提供用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子害虫抗性的组合物和方 法。组合物包含编码S-内毒素多肽序列的核酸分子、包含那些核酸分子的载体和包含载 体的宿主细胞。组合物还包含该内毒素的多肽序列和那些多肽的抗体。该核苷酸序列可以 用于用来在生物体(包含微生物和植物)中转化和表达的DNA构建体或表达盒中。核苷酸 或氨基酸序列可以是设计用于在包含但不限于微生物或植物的生物体中表达的合成序列。 组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体而言，提供对应于δ-内毒素核酸序列的分离的核酸分子。此外，涵盖对应 于该多核苷酸的氨基酸序列。具体而言，本专利技术提供编码包含编码SEQ ID NO :61-121和 133-141中任一项所示的氨基酸序列的核苷酸序列的分离的核酸分子，或SEQ ID NO 1-60 和1M-132中任一所示的核苷酸序列，以及其变体和片段。还涵盖与本专利技术的核苷酸序列 互补的核苷酸序列，或与本专利技术的序列杂交的核苷酸序列。本专利技术的组合物和方法用于产生具有杀虫剂抗性的生物体，尤其是细菌和植物。 这些生物体和从它们衍生的组合物是为了农业目的而希望得到的。本专利技术的组合物还用于 产生改变的或改进的具有杀虫活性的S-内毒素蛋白质，或用于检测δ-内毒素蛋白质或 核酸在产物或生物体中的存在。专利技术详述本专利技术涉及用于在生物体，尤其是植物或植物细胞中调节害虫抗性的组合物和方 法。该方法涉及用编码本专利技术的S-内毒素蛋白质的核苷酸序列转化生物体。具体而言， 本专利技术的核苷酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，提供转化的细菌、植 物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是苏云金芽孢杆菌S-内毒素的核酸和蛋白质。这 些序列用于构建表达载体用于随后转化进入目的生物体，作为用于分离其他S -内毒素基 因的探针，和用于通过本领域已知的方法，如结构域交换或DNA改组产生改变的杀虫蛋白。 这些蛋白质用于控制或杀死鳞翅目、鞘翅目和线虫类害虫群体，并用于产生具有杀虫活性 的组合物。“ δ -内毒素”指具有针对一种或多种害虫的毒性活性的源自苏云金芽孢杆菌的毒 素，或与这种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述一种或多种害虫包含但不限于鳞翅目、双翅 目和鞘翅目的成员或线虫动物门(Nematoda phylum)的成员。在一些情况下，已从包含双 酶梭菌(Clostridium bifermentans)和日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae) 的其他生物体分离了 S-内毒素蛋白质。S-内毒素蛋白质包含从本文公开的全长核苷酸 序列推断的氨基酸序列，和由于使用其他下游起始位点或由于产生具有杀虫活性的较短蛋 白质的加工而比全长序列短的氨基酸序列。加工可以发生在表达该蛋白质的生物体中，或 该蛋白质被摄入后发生在害虫体内。δ-内毒素包含鉴定为cryl至cry43、cytl和cyt2和Cyt-样毒素的蛋白质。目前已知超过250种具有大范围的特异性和毒性的δ-内毒素。全面的列表见Crickmore 等(1998)，Microbiol. Mol本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列： ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－６０和１２４－１３２中的任意核苷酸序列； ｂ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－６０和１２４－１３２中任意核苷酸序列具有至少９０％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽； ｃ）编码包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－１２１和１３３－１４１中任意氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和 ｄ）编码与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－１２１和１３３－１４１中任意氨基酸序列具有至少９０％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/075,7192008年6月25日1.分离的核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列a)SEQ ID NO :1-60和124-132中的任意核苷酸序列；b)与SEQID NO :1-60和124-132中任意核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷 酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽；c)编码包含SEQID NO :61-121和133-141中任意氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)编码与SEQID NO :61-121和133-141中任意氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列 同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性。2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已设计用于在植物中表达的 合成序列。3.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自SEQID NO :142-283中的 任一个。4.载体，其包含权利要求1的核酸分子。5.权利要求4的载体，其还包含编码异源多肽的核酸分子。6.宿主细胞，其包含权利要求4的载体。7.权利要求6的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。8.权利要求6的宿主细胞，其是植物细胞。9.转基因植物，其包含权利要求8的宿主细胞。10.权利要求9的转基因植物，其中所述植物选自玉蜀黍、高粱、小麦、甘蓝、向日葵、西 红柿、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。11.具有杀虫活性的分离的多肽，其选自以下a)包含SEQID NO :61-121和133-141中的任意氨基酸序列的多肽；b)包含与SEQID NO :61-121和133-141中任意氨基酸序列具有至少90%序列同一性 的氨基酸序列的多肽；c)由SEQID NO :1-60,124-132 ^P 142-283中任意核苷酸序列编码的多肽；禾口d)由与SEQID NO :1-60、124-132和142-283中任意核苷酸序列至少90%相同的核苷 酸序列编码的多肽。12.权利要求11的多肽，其还包含异源氨基酸序列。13.抗体，其选择性结合权利要求11的多肽。14.组合物，其包含权利要求11的多肽。15.权利要求14的组合物，其中所述组合物选自粉末、粉剂、丸、颗粒、喷雾、乳剂、胶体 和溶液。16.权利要求14的组合物，其中通过脱水...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·阿加瓦尔，
申请(专利权)人：阿森尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：US
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