本发明专利技术涉及用于蛋白性分子的同位素／同量异位素标记以及后续亲和选择和分析的试剂盒和方法。特别地，本发明专利技术涉及包括用于标记蛋白性分子的组合的多种标记试剂的由各部分组成的试剂盒，每种标记试剂包括同量异位素标记组分、同位素标记组分和能够与蛋白性分子反应的反应基团，其中同位素标记组分同时是亲和标记物。本发明专利技术还涉及用于分析蛋白性分子的相应方法，其包括通过采用如本文定义的由各部分组成的试剂盒标记存在的至少一个蛋白性分子亚组，和随后经由标记中包括的亲和标记物，通过亲和纯化来分离标记的分子。最后，本发明专利技术涉及此类方法用于蛋白质表达概况分析或蛋白质组分析的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术主题本专利技术涉及用于通过使蛋白性分子的同位素和同量异位素双重标记与其借助于 同时充当同位素标记组分的亲和标记物的后续亲和纯化偶联，从复杂样品分离和后续分析 蛋白性分子的化合物、和优选地包括此类化合物的试剂盒以及方法。
技术介绍
从复杂样品鉴定、分离和分析特定蛋白质或蛋白质亚组对于揭示生物过程如何在 分子水平上发生或蛋白质在各种细胞类型中或在生理学状态之间不同至何种程度是极有 价值的。现代生物学中的主要挑战涉及由生物编码的完整蛋白质组的表达、功能和调节的 理解，即，通常称为蛋白质组学的
然而，因为不存在扩增蛋白质的可能性，所以这 个领域中的研究一般是相当繁重的，因为即使相对简单的原核生物的细胞提取物也包含包 括巨大浓度范围的许多蛋白质。因此，此类任务超出了任何目前简单分析法的能力。因此，由于方法约束，蛋白质组分析不仅依赖于鉴定且定量蛋白质的方法，还在相 当大的程度上也依赖于根据其结构和/或功能性质允许其精确和可靠分离的方法，其中这 些亚组随后更容易用于进一步分析。蛋白质组具有动态性质，其响应外部刺激或细胞环境中的改变而在蛋白质合成、 激活和/或翻译后修饰中有改变。因此，蛋白质组的固有复杂性超过基因组或转录组(细 胞的mRNA互补序列)的复杂性。由于在此类蛋白质组学研究中待处理的超乎寻常的数据量，蛋白质/肽鉴定过 程需要极大的分辨能力。通常用于分辨此类高度复杂混合物的两种方法是二维凝胶电泳 (2D-GE ；参照例如，0 ‘ Farrell, P. H. (1975) J. Biol. Chem. 250，4007-4021)和(二维) 液相色谱((2D)-LC ；参照例如，Lipton, M.S.等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 11049-11054)。通过2D-GE或2D-LC分离的肽和蛋白质通常通过质谱法或通过测定氨基酸 组成和/或氨基酸序列进行鉴定。然而，尽管对于许多应用有用，但这些鉴定技术就待研究高度复杂样品的蛋白质 组学研究而言具有较大缺点。例如，疏水膜蛋白质、高碱性或酸性蛋白质、极大或极小蛋白 质经由2D-GE通常弱分辨。此外，这些方法的检测(灵敏度)限制以及标记技术中的不足 不允许多个样品的平行可靠分析，例如比较不同疾病组之间、疾病的不同进展阶段和疾病 状态与健康对照之间的相对蛋白质水平，或用于执行高通量筛选分析例如蛋白质表达概况 分析或蛋白质生物标记的鉴定。目前，存在使得能够鉴定和表征给定样品中的特定蛋白质的几种可用技术，例如 质谱法。然而，总体蛋白质组研究一般由于检测的有限灵敏度而被妨碍。因此，需要可能干 扰进一步分析的另外分级分离、富集或选择步骤(例如，通过亲和纯化)，以便减少样品的 复杂性。决定统计上显著的测定结果中的另一个问题是多个样品之间蛋白质表达的差异的 相对定量。因此，高度希望开发克服上述局限性且使得能够平行处理多个重复杂样品的方 法，以便减少不同的单个样品之间的方法学变异性，并且因此增加所获得的测定结果的统计学显著性。近来，已开发了用于蛋白质标记的两种不同方法以便解决这个目标。第一种技术被称为同位素编码的亲和标记物(Isotope-Coded Affinity Tag) (ICAT)技术，且允许基于关联蛋白质混合物的差异同位素标记的定量蛋白质组分析(参照 Gygi等人(1999)Nat. Biotechnol. 17，994-999)。即，这种标记方法采用一组标记，其具有 相同化学式，但在一种或多种原子中存在的同位素数目和/或类型方面彼此不同，导致质 量差异。所述的ICAT试剂使用3种功能元件用于选择性标记被还原的半胱氨酸残基的硫 醇反应基团、允许选择性分离半胱氨酸标记的肽的生物素亲和标记物、和以两种同位素形 式——“轻”(非同位素)或“重”(利用咕或13C)形式合成的同位素标记物。因为给定样 品中仅相对中等数目的蛋白质在其一级序列中包含半胱氨酸残基，所以导致样品的复杂性 降低，这随后促进后续样品处理的可靠性。可替代方法利用被称为用于相对和绝对定量的同量异位素标记物(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) (iTRAQRoss, P. L. ^A (2004)Mol. Cell. Proteomics 3,1154-1169)的同量异位素标记的试剂。这种方法采用4种不同试剂， 其各自包含报道基团、平衡基团和与伯胺基团反应的肽反应基团。报道基团具有114、115、 116或117Da的质量，这取决于每种试剂中12C/"C和160/180的差异同位素组合。平衡基团 的质量从31到^Da不等，以确保报道基团和平衡基团的组合质量对于4种试剂保持恒定 (145Da)。因此，用这些试剂各自标记相同肽得到同量异位且因此可用色谱法彼此区分的肽 (即，所有促成在MS分析中观察到且用于CID的一个离子种类)。然而，在MS/MS串联质谱 法过程中，至少各自的报道基团在碰撞诱导的解离(CID)后释放，显示114-117Da的独特质 量。这些片段的强度可以用于在单次实验中定量单个蛋白质和/或肽。这导致信号强度增 加，且因此正确鉴定肽特别是低丰度肽的可能性增加。上述ICAT和iTRAQ技术允许两种(ICAT)或最高达4种(iTRAQ)单个样品的多路 技术且允许使其同时处理，从而使技术变异性降到最低。然而，这两种方法都具有明显局限 性。ICAT方法即使允许快速筛选蛋白质表达差异，但局限于仅两种样品例如两个疾病 组的研究，其通常不代表疾病相关组(例如，疾病的不同进展阶段)的完全谱。因此，具有 允许研究超过两个组的可用技术将是有利的。另一方面，iTRAQ技术尽管允许多样品分析，但具有明确缺点它需要对每种MS信 号(对于未标记和标记的蛋白质和/或肽)执行MS/MS扫描用于信号的相对定量。在实践 中，当原材料具有高度复杂性例如在人血清或其他体液中时，这是不可行的，因为分析将是 非常费时的。因此，仍需要用于蛋白性分子的改良标记试剂和包括此类标记试剂的试剂盒，以 及克服上述局限性且使得能够平行处理多个复杂样品的相应标记方法。特别地，希望提供 同时允许标记的蛋白性分子的后续选择性纯化和分析的标记方法。专利技术目的和简述本专利技术的目的是提供用于对来自复杂样品的蛋白性分子进行标记以及后续分离 和分析的新化合物和相应方法。更具体而言，本专利技术的一个目的是提供用于平行执行多个 此类分析的方法。通过独立权利要求的主题实现从下述描述显而易见的这个目的以及其他目的。本专利技术的某些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。在第一个方面，本专利技术涉及用于标记蛋白性分子的标记试剂，其包括(a)同量异位素标记组分；(b)同位素标记组分；和(C)能够与蛋白性分子反应的反应基团；其中同位素标记组分同时是亲和标记物。在一个优选实施方案中，本专利技术涉及由各部分组成的试剂盒(kit-of-parts)，其 包括用于标记蛋白性分子的η ·πι种组合的多种标记试剂(a combinatorial plurality of η · m labeling reagents)，每禾中标记试齐抱括(a)同量异位素标记组分；(b)同位素标记组分，本文档来自技高网...
【技术保护点】
由各部分组成的试剂盒，其包括用于标记蛋白性分子的ｎ·ｍ种组合的多种标记试剂，每种标记试剂包括： （ａ）同量异位素标记组分； （ｂ）同位素标记组分，其同时是亲和标记物；和 （ｃ）能够与蛋白性分子反应的反应基团； 其中所述整数ｎ≥４，并且代表差异标记的同量异位素标记组分的数目；并且 其中所述整数ｍ≥２，并且代表差异标记的同位素标记组分／亲和标记物的数目。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·霍夫曼，
申请(专利权)人：皇家飞利浦电子股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NL
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