细胞的遗传学分析制造技术

一些方面涉及对异质细胞群中的选择的细胞进行遗传学分析的方法。首先可以分配细胞群。通过成像鉴定所选择的细胞，并然后通过用能量束辐照来特异性靶向和裂解所选择的细胞，从而导致特异性释放它们的细胞内容物到培养基中。然后可以对培养基取样并测定期望的核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞的遗传学分析背景在细胞的异质混合物中特定细胞的细胞核酸如mRNA或基因组DNA的分析通常是如下进行的通过原位分析若干个分析物，通常是1-10个；或通过从背景群中机械分离期望的细胞，然后收集并分析所分离的细胞的内容物。直接在未纯化的混合物中分析细胞的原位分析方法包括原位杂交(ISH)。ISH通常用于在细胞或组织切片中检测特定mRNA或DNA序列，并且其受一次实验中可以测量的分析物数目的限制。通常，在一个实验中进行1个或2个分析物的I SHaoung WS 3rd Methods Enzymo 1. (1989) 168 :702_10，其整体通过引用并入本文)。原位分析方法的特征均在于直接分析细胞样品背景中的细胞内容物，而没有细胞纯化并且没有收集或储存用于后续分析的细胞内容物。原位分析方法通常是经由人工的显微观察进行的并且不易于高通量扩大化或自动化。在收集细胞内容物之前纯化细胞的机械分离方法包括基于抗体的磁珠细胞纯化(例如，MACS 细胞分离，Miltenyi Biotec, Germany)、流式细胞分选、激光显微切割或机械显微切割。一旦细胞被分离，便可进行高度复杂的分析，诸如完整的基因表达概况分析。这些多种细胞分离方法的每一种具有其自身的益处和局限。例如，磁珠纯化和流式分选需要相对大量的细胞以便正确工作，很少达到分离的细胞的绝对纯度并且选择参数一般局限于几个表面标志物。激光显微切割可以分离单个细胞或许多细胞，但是可以加工的样品数目受限，并且一般适用于具有特定需要的组织样本(Luo等人，NatMed. (1999)5(1) 117-22，其整体通过引用并入本文)。机械显微切割在可以加工的细胞数目和样品数目两方面都受限。对于所有这些分离方法来说，由于许多感兴趣的细胞在加工期间丢失的产率问题而使分析细胞、尤其是稀有细胞成为挑战。不同细胞类型的复杂混合物中特定细胞的核酸分析的一个应用是循环肿瘤细胞和播散肿瘤细胞的遗传学分析。这些细胞由原发性肿瘤脱落并存在于血液循环或淋巴循环中或位于各种组织中。播散肿瘤细胞被认为是转移的原因。鉴于大多数因癌症疾病所引起的死亡是由于转移而不是原发性肿瘤所致，循环和播散肿瘤细胞成为具有强烈诊断兴趣的主题。例如，Veridex LLC (Warren, NJ)开发了一项FDA批准的诊断测试，该测试列举了循环乳腺肿瘤细胞的数目作为预后工具。然而，除了检测循环肿瘤细胞的存在的诊断价值之外，还高度期望的是能够将这些细胞从分子上分类。这种信息可以揭示更好的预后信息并指导治疗选择。例如，是赫塞汀治疗靶的Her-2受体仅在乳腺癌患者的一个亚群体中过表达，剩余的乳腺癌患者群体对赫塞汀治疗无反应。这个实例强调了对个体化的癌症治疗的需要。循环肿瘤细胞和播散肿瘤细胞的分子概况分析在鉴定合适标志物的发现期和在执行所鉴定的标志物的诊断期均提出重大的技术挑战。这种挑战在于期望的细胞的贫乏，贫乏至1/100，000乃至1/10，000, 000，这需要格外有效的方法来纯化。目前，循环肿瘤细胞的遗传学分析或分子概况分析主要在通过抗体介导的分离富集的肿瘤细胞上进行。整体通过引用并入本文的Smirnov等人，Cancer Res. (2005)65(12) 4993-7报道了通过从人血免疫磁性分离而富集的循环肿瘤细胞的基因表达概况分析。所报道的研究的局限是富集的肿瘤细胞纯度不够，该富集的肿瘤细胞数目不如污染的白细胞多。只有在获得至少100个肿瘤细胞并且背景为小于1，000-10，000个白细胞时才能产生有用的基因表达数据。这些局限将患者的选择限制在具有> 100个/7.5ml血液的高循环肿瘤细胞计数的那些患者中，这是一个严重的限制；因为研究显示大多数癌症患者在 7. 5ml血液中具有小于10个循环肿瘤细胞(Allard等人，Clin Cancer Res. (2004) 10(20) 6897-904，其整体通过引用并入本文)。此外，白细胞的污染将分析局限于被肿瘤细胞高度表达的基因。最后，使用针对特定抗原如EpCAM的抗体正向选择循环肿瘤细胞具有固有的弱点。已知的是循环肿瘤细胞在暴露的表面抗原的量方面显示出显著的异质性，这导致捕获这些细胞的可变效率(Allard等人，Clin Cancer Res. (2004) 10(20) :6897-904)，继而威胁到测定的灵敏性。使用抗体选择来分离循环肿瘤细胞的不同系统是CTC芯片(Nagrath等人， Nature. (2007)450(7173) :1235_9，其整体通过引用并入本文)，该CTC芯片由具有通过深离子刻蚀(deep ion etching)制造的78，000个微柱(micropost)的流动室组成。微柱被 EpCAM的抗体覆盖。在血液被抽吸通过室时，循环肿瘤细胞保留在微柱上。通过RT-PCR对捕获的细胞进行少量基因的分析。发表的数据显示了分离的循环肿瘤细胞的不同纯度，6个癌症类型的平均纯度为56% (Nagrath等人，Nature. (2007)450(7173) :1235_9，其整体通过引用并入本文)。同样，样品不纯将威胁基因表达谱的品质。而且，此方法易受肿瘤细胞所展示的EpCAM量的变化而引起的灵敏度可变性的影响。概述本文所述的系统、方法和装置各自可以具有几个方面，没有一个方面单独地负责期望的属性。不限制由随后的权利要求所表达的本公开内容的范围，现在将简要地讨论本公开内容较显著的特征。在考虑了本讨论之后，尤其是阅读了标题为“详述”的部分之后， 本领域的技术人员将理解这种技术的特征如何提供优势，包括相对快速和精确地分析细胞群中的细胞，包括稀有细胞。本文所公开的一些实施方案涉及对异质细胞群中存在的细胞进行特定遗传学分析的方法。在一些实施方案中，鉴定感兴趣的细胞，通过用足以引起靶细胞裂解的能量辐照所鉴定的细胞而使所鉴定的细胞释放它们的细胞内容物到周围培养基中，对含有释放的核酸的培养基取样并分析存在于取样的培养基中的核酸。在一些实施方案中，可以通过下列方法达成细胞的裂解降低孵育培养基的摩尔渗透压浓度以使细胞通过渗透作用吸收水分并随后通过添加促溶剂，如使蛋白变性的硫氰酸胍；或通过添加表面活性剂，如破坏细胞膜并使蛋白变性的十二烷基磺酸钠而破裂。注意尽管本文的许多实例涉及的是核酸分析，但任何细胞内容物均可以通过这些方法来分析，包括蛋白、代谢产物等。一些实施方案涉及从异质细胞群中的稀有细胞中分离核酸的方法。例如，方法可以包括(a)将异质细胞群分配到多个室(bin)中，使得含有稀有细胞的室中稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域快速成像以确定哪些室含有稀有细胞；(C)添加试剂到含有稀有细胞的室中以使细胞裂解并从稀有细胞中释放核酸到培养基；以及(d)只从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从稀有细胞收集核酸。在一些方面，方法可以包括例如(a)将异质细胞群分配到多个室中，使得含有稀有细胞的室中稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域快速成像以确定哪些室含有稀有细胞；(C)通过参考各室的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种从异质细胞群中的稀有细胞分离核酸的方法，所述方法包括：（ａ）将所述异质细胞群分配到多个室中，以便使在含有所述稀有细胞的室中所述稀有细胞的浓度增加至少Ｘ倍，其中Ｘ是室的数目除以所述异质细胞群中稀有细胞的数目；（ｂ）对每个室的基本上整个区域成像以确定哪些室含有所述稀有细胞；（ｃ）添加试剂到含有所述稀有细胞的室中以使细胞裂解并从所述稀有细胞释放核酸到培养基中；以及（ｄ）只从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从所述稀有细胞收集核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德里克·坎曼，
申请(专利权)人：英特拉克森公司，
类型：发明
国别省市：US