得到免疫球蛋白编码核酸的方法技术

本发明专利技术涉及从单细胞中得到编码免疫球蛋白可变结构域的核酸的方法，其包括以下步骤：用３至６条５′－引物和１条３′－引物进行第一个聚合酶链式反应，用１３至１６条５′－引物和１条３′－引物和第一个聚合酶链式反应的产物进行第二个聚合酶链式反应，其中在第二个聚合酶链式反应中使用的引物的结合位置的距离相比第一个聚合酶链式反应减少。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用多重聚合酶链式反应(PCR)从单个免疫球蛋白生产细胞和手段，也涉及产生免疫球蛋白的方法，其中结合体外翻译从单个免疫球蛋白生产细胞得到免疫球蛋白编码核酸。本专利技术也包含表征重组产生的人Fab片段的方法。
技术介绍
^ JA ^ ^iM ^^ (Cole, S. P. C. , ^ 人，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985)；禾口 Boerner，P.，等人，J. Immunol. 147(1991)86—95) 建立以来，单克隆抗体开始在科学研究、人类健康和诊断中发挥关键作用。因此，单克隆免疫球蛋白特别是治疗免疫球蛋白的产生是正在进行深入研究的领域。在这方面，其中杂交瘤技术和噬菌体展示技术(Hoogenboom，H. R.，and Winter, G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等人，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)是产生单克隆免疫球蛋白的2个常用技术。在杂交瘤技术中得到稳定克隆是一大障碍，由于仅有限数目的B细胞被成功地融合、增殖和之后被表征，因此减少了抗体的多样性。类似地，基于噬菌体或酵母展示的组合文库方法的一大缺点是免疫球蛋白重链和轻链的随机配对。原始的重链和轻链配对的解离和非同源配对使筛选大量免疫球蛋白生产细胞以鉴定高亲和力的重链和轻链对成为必要。此外，这些非同源对可能展示对人抗原的不需要的交叉反应。最后，由于固有的选择性偏差通过选择和筛选组合文库鉴定的靶特异性免疫球蛋白的遗传多样性通常是有限的。根据本领域已知的方法可从免疫球蛋白生产细胞进行免疫球蛋白的产生。这些方法为例如杂交瘤技术。另一种方法是基于免疫球蛋白核酸序列的鉴定。通常鉴定可变区的序列就够了，或者甚至仅鉴定⑶R区或仅鉴定⑶R3区的序列。例如，使用从免疫球蛋白生产细胞库分离的mRNA构建编码免疫球蛋白CDR区的cDNA文库。然后将cDNA文库转染至合适的宿主细胞，例如NSO或CH0，并筛选特异的免疫球蛋白产生。WO 2008/104184报导了克隆同源抗体的方法。Tiller等人(Tiller，T.，等人，J. Immunol. Meth. 329 (2007) 112-124)报导了从单个人B细胞有效产生单克隆抗体。Braeuninger 等人(Braeuninger，Α.，等人，Blood 93(1999)2679-2687)报导了来自富含T细胞的B细胞淋巴瘤的单个B细胞的分子分析。Rohatgi等人(Rohatgi，S.，等人，J. Immunol. Meth. 339(2008)205-219)报导了嵌套式(RT-) PCR引物的系统设计和检测。在WO 02/13862中报导了改变B细胞介导的病理学的方法和组合物。Haurum等人 (Meijer,P. J.和 Haurum，J. S. , J. Mol. Biol. 358 (2006) 764-772)报导了一步 RT-多重重叠延伸PCR。Stollar等人和Junghans等人报导了通过单细胞PCR反应的序列分析(Wang， X.禾口 Stollar，B. D.，J. Immunol. Meth. 244(2000)217—225 ；Coronella, J. A.禾口 Junghans， R. P. , Nucl. Acids Res. 28 (2000) E85)。 Jiang, X.禾口 Nakano，H.，等人(Biotechnol. Prog. 22(2006)979-988)报导了用于体外转录和翻译的线性表达元件的构建。专利技术概述在一个方面的特定实施方案中本专利技术涉及提供人单克隆抗体的方法，其包括编码人免疫球蛋白G片段的核酸的体外翻译，其中所述核酸通过cDNA片段的特异性扩增得到， 所述cDNA片段从单个产生免疫球蛋白的人B细胞、成浆细胞或浆细胞或包含人免疫球蛋白基因座的动物的B细胞的mRNA处得到。通过此方法有可能就产生的免疫球蛋白的抗原结合特征表征提供的许多B细胞中的每个。因此，不会发生免疫球蛋白多样性的损失。由于分析的B细胞是在体内成熟过程以后得到的成熟B细胞，它们产生的免疫球蛋白与其他抗原显示交叉反应的可能性非常低。本专利技术包含从单个B细胞或成浆细胞或浆细胞扩增同源IgG HC和IgGLC链(人 IgG同种型)的多重半嵌套式PCR和多重单管RT-GSP-PCR(RT-基因特异性引物-PCR)的方法。之后将Fab PCR产物转录为mRNA并在大肠杆菌裂解物中体外翻译。使用ELISA和蛋白质印迹检查表达。作为第一个方面，本专利技术包含从单细胞中得到编码免疫球蛋白可变结构域的核酸的方法，其包括以下步骤-通过使用3至6条5’-引物和1条3’-引物进行第一个聚合酶链式反应得到第一个核酸组合物，-通过使用13至16条5’-引物和1条3’-引物使用在第一个聚合酶链式反应中得到的组合物进行第二个聚合酶链式反应，得到编码免疫球蛋白可变结构域的核酸，其中，当与待扩增的核酸结合时，相比第一个聚合酶链式反应，在第二个聚合酶链式反应中使用的5’ -引物的结合位置和3’ -引物的结合位置间的距离减少。本专利技术的第二个方面是从单细胞中得到编码免疫球蛋白可变结构域的核酸的方法，其包括以下步骤-通过使用4至6条5’-引物和1条3’-引物进行第一个聚合酶链式反应得到核酸组合物，-通过使用13至15条5’-引物和1条3’-引物和使用在第一个聚合酶链式反应中得到的组合物进行第二个聚合酶链式反应，得到编码免疫球蛋白可变结构域的核酸，其中在第二个聚合酶链式反应中，5’ -引物与第一个聚合酶链式反应中的相同而 3’ -引物改变，或3’ -引物与第一个聚合酶链式反应中的相同但至少一个5’ -引物改变，从而，当与待扩增的核酸结合时，相比在第一个聚合酶链式反应中的各5’ -引物的5’-端和3’-引物的3’-端之间的核苷酸数目，在第二个聚合酶链式反应中的各5’-引物的5’ -端和3’ -引物的3’ -端之间的核苷酸数目减少。本专利技术的另一个方面是从单细胞中通过多重单管RT-GSP-PCR得到编码免疫球蛋白可变结构域的核酸的方法，其包括以下步骤-使用1条5’-引物和1条3’ -引物在一个步骤中进行逆转录和聚合酶链式反应。在一个实施方案中根据本专利技术的方法的特征在于在第一个聚合酶链式反应中使用的5’-引物结合免疫球蛋白前导肽的编码区。在另一个实施方案中根据本专利技术的方法的特征在于在第二个聚合酶链式反应中使用的5’ -引物或在多重单管RT-GSP-PCR中使用的 5’_引物结合免疫球蛋白第一框架区的编码区。在另一个实施方案中根据本专利技术的方法的特征在于在第二个聚合酶链式反应中使用的引物为5’-引物提供编码翻译起始密码子ATG的突出端和/或为3’_引物提供编码翻译终止密码子TTA的突出端。在另一个实施方案中根据本专利技术的方法的特征在于包括另外的步骤-提供单细胞和得到此细胞的mRNA。在另一个实施方案中根据上述实施方案的方法的特征在于包括以下第二步骤-用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)从提供的mRNA处得到cDNA。在另本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．从单细胞中得到编码免疫球蛋白可变结构域的核酸的方法，其包括以下步骤：－用３至６条５′－引物和１条３′－引物进行第一个聚合酶链式反应，－用１３至１６条５′－引物和１条３′－引物和第一个聚合酶链式反应的产物进行第二个聚合酶链式反应，其中在第二个聚合酶链式反应中使用的引物的结合位置间的距离相比在第一个聚合酶链式反应中的距离减少。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·W·克雷尔，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH