琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化制造技术

本发明专利技术涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸－甲酸－裂解酶活性，并涉及利用此类微生物生产有机酸，特别是琥珀酸的方法。本发明专利技术还涉及通过阳离子交换层析对所生产的有机酸的下游加工。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化本专利技术涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含下调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性，并涉及利用此类微生物生产有机酸，特别是琥珀酸的方法。专利技术背景 从生物质发酵生产琥珀酸(SA)已引起了广泛关注，因为所述酸是合成树脂的重要成分，或者是其他有价值的低分子化学化合物的来源，特别是四氢呋喃(THF)、1，4_ 丁二醇(BFO)、Y-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮(W0-A-2006/066839)。Lee等(2002a)描述了从牛的瘤胃分离的SA生产菌。所述细菌是不动的、不形成芽孢的、嗜中温和嗜二氧化碳的革兰氏阴性的杆状或球杆菌。基于16S rRNA序列的系统发生学分析和生理学分析表明所述菌株属于曼海姆菌(Marmheimia)属，作为新种，被称为产琥珀酸曼海姆菌(Mannheimia succiniciproducens)MBEL55E。在 100 % CO2 条件下，它在 6.0-7.5的pH范围内生长良好，并以2 1 1的恒定比例生产SA、乙酸和甲酸。当CO2 饱和条件下，用葡萄糖作为碳源，无氧培养产琥珀酸曼海姆菌MBEL55E时，在孵育7. 5h里， 消耗了 19.8g/L的葡萄糖，产生了 13.3g/L的SA。此外，在该微生物中，通过突变/删除代谢基因，改善了 SA的生产。乳酸脱氢酶IdhA、丙酮酸-甲酸-裂解酶pFIB、磷酸转乙酰基酶pta和乙酸激酶ackA基因的组合突变/删除导致菌株将碳转化为SA的产量(YP/S)为 0. 6gSA/g添加的碳源。生产SA的时空产量为1. 8g/升/h(Lee，2006)。Lin等，2005描述了在Idh和pfl基因中都携带突变的大肠杆菌的变体菌株，称为 SB202。然而，该菌株的特征是生长缓慢，且在无氧条件下不能完全发酵糖类。失活的Idh 和PfI导致碳流动被限制于丙酮酸节点，导致丙酮酸作为主要产物积累。在该方面，发现基于碳源的琥珀酸的碳产量(YP/S)低于0. 15g/g SA/碳。Sanchez等，2005描述了在Idh、adhE、ack-pta和icIR基因中携带突变的大肠杆菌菌株。在这些实验中，细胞有氧的生长在复杂培养基上，在有氧条件下收获、浓缩和用碳源孵育。在这些用于将碳水化合物直接转化为SA的特定条件下，发现碳产量YP/S为0. 98 至1. 13g SA/g碳源，时空产量为0.79g/l h SA。在好氧转化阶段前的生物量生产的碳利用明确的不包括在该计算中，且未进行进一步描述。Hong和Lee (2001)描述了在Idh和pfl基因中携带突变的大肠杆菌菌株。这些菌株确能从碳水化合物发酵中生产SA，然而，伴随缓慢的碳水化合物利用和从碳水化合物碳源葡萄糖的低的SA时空和碳产量(YP/S)。此外，产生琥珀酸、乙酸和乳酸的比例为 1 0.034 1.6。在该分析中，与未突变的亲本菌株相比，在Idh和pfl基因中携带突变的菌株的生长是迟缓的。Zhu等，2005描述了在pfl基因中突变的E. coli菌株，其不产生琥珀酸，但产生乳酸，当在以葡萄糖为惟一底物的条件下生长时，表现出低下的生长。然而，生物产琥珀酸曼海姆菌的重要缺陷是它不能代谢甘油，而甘油作为三酰基甘油(TAG)的组分是便于获得的，例如作为生物柴油生产的酯基转移反应中的副产品 (Dharmadi 等，2OO6)。科学文献中已描述了从甘油发酵生产SA(Lee等，2001 ；Dharmadi等，2006)，并且甘油获得了比普通糖类如葡萄糖更高的产量(生产的SA的质量/消耗的原材料的质量) (Lee等，2001)。然而，用甘油获得的时空产量显著低于葡萄糖(0. 14vs. 1. Og SA/)。仅在少数情况下描述了将甘油无氧代谢成发酵产物。E. COli能够在非常特定的条件下发酵甘油，例如酸性PH，避免积累发酵氢气，以及恰当的培养基组成(Dhamadi等， 20 06，Yazdani和Gonzalez 2007)。许多微生物能够在存在外部电子受体的条件下代谢甘油(呼吸代谢)，极少数能够发酵代谢甘油(即，在缺少电子受体的条件下)。在肠杆菌科的若干个种中，已详细的研究了甘油的发酵代谢，例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。这些生物体中的甘油异化作用与它们合成高度还原的产物1，3_丙二醇(1，3-PD0)的能力是严格相关的(Dhamadi等， 2006)。已报道了使用产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)将甘油转化为SA (Lee等，2001)。该研究证实，使用甘油作为碳源可以生产SA并极少形成副产物乙酸，因而有利于SA的纯化。通过间歇性添加甘油和酵母提取物，获得最高产量，该对策获得约19g/L SA的产量。然而应注意，酵母提取物中存在进行甘油发酵所需的未鉴定的营养组分。然而，由于糖类比多元醇甘油更低的还原状态，糖类理论上应该以比甘油显著更低的产量转化为SA。发现在生产SA的厌氧性生物体中，糖类与甘油的组合是有作用的(Lee 等，2001)，但没有达到超过29g/L的SA滴度。此外，发现碳产量YP/S仅为92%，而SA/AA 比为4. 9 1。最多仅4g/L甘油转化为琥珀酸。由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPG)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和丙酮酸羧化酶(PycA)催化的草酰乙酸的羧化反应利用HCO3-作为CO2源(Peters-WendischPG等， 1996，1998)。因此，碳酸氢盐来源例如NaHCO3、KHCO3、NH4HCO3等可用于发酵和培养基质，以改善底物至SA的代谢中HC03_的利用度。迄今为止的现有技术中尚未发现从葡萄糖生产SA 依赖于添加HCO3_。厌氧生物体的生物质生产受从发酵通路生产的ATP量的限制。厌氧生物体中的甘油的生物量产量低于糖类的，例如己糖如葡萄糖、果糖，戊糖如木糖、阿拉伯糖或二糖例如蔗糖或麦芽糖(Lee 等，2001，Dharmadi2007)。早期的专利申请PCT/EP2008/006714公开了这样的细菌菌株，其属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的成员，从瘤胃中原始分离，并能够利用甘油作为碳源，来源于它的变体和突变菌株保留了所述能力，特别是以保藏编号DSM 18541 (ID 06-614)保藏在 DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克，因霍芬路7B，德国)中的命名为DDl的细菌菌株，具有生产琥珀酸的能力，来源于它的变体和突变菌株至少保留了所述生产琥珀酸的能力，该申请的内容通过引用整合到本文中。根据Kuhner等，2010的分类，DDl菌株属于Basfia succiniciproducens禾中，巴斯德氏菌禾斗0因此，需要新型的细菌菌株，其具有从甘油生产有机酸，特别是SA的能力。特别的是，此类菌株应该以高生产力从甘油生产所述酸类，尤其是可以使用不进行在先纯化、例如来自生物柴油生产的粗制甘油。本专利技术的目标是提供此类新型菌株和生产方法。专利技术概述本专利技术人分离了名为DDl的细菌菌株，令人惊本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸－甲酸－裂解酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·施罗德，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：DE