基于白蛋白的三维结构，发明专利技术人设计了具有一个或多个带有游离巯基的半胱氨酸残基的变体多肽（ｍｕｔｅｉｎ）（下文中称作“硫代白蛋白”）。变体多肽可以通过半胱氨酸残基的硫原子与缀合配偶体如生物活性化合物缀合。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能缀合的白蛋白(conjugation competent albumin)和白蛋白相关多肽，和它们与至少一种模块(moiety)的缀合物，并且涉及编码它们的多核苷酸。
技术介绍
血清白蛋白为可以融合的生物活性分子提供有价值的支架，其或者通过遗传融合或者通过化学融合以改善融合分子的性质(Leger，R.等(2004). Bioorg Med Chem Lett 14(17) :4395-8 ；Thibaudeau, K.,等(2005) · Bioconjug Chem 16(4) :1000-8 ；Balan, V.等(2006). Antivir Ther 11(1) 35-45 ；EP O 413622 ；WO 90/13653 ；EP 1 681 304 ；WO 1997/024445 ；WO 01/79271)。白蛋白和白蛋白颗粒对于将药物和前药携带并递送至它们的作用位点也很重要(Kratz (2008) Journal of Controlled Release，132 (3)，p. 171-183)。 鉴于改进的药代动力学性质，如半衰期的延长，融合和颗粒技术提供了改进的剂量给药方案，并可以改进生物利用度且保护所述融合的生物活性分子免于失活。白蛋白的生物化学、遗传学和医学应用是得到充分表征的(“All about Albumin，，，Τ· Peters Jr. ,Academic Press N. Y.，禾口http://www. albumin, org/)。人血清白蛋白(HSA，也称作HA)以 60g/L而是人血浆中最丰富的蛋白质。HSA的序列在SEQ ID No. 1 中提供。存在HSA的天然变体并且在Minchiotti等(2008). Hum Mutat 29(8) :1007-16中和http://www. uniprot. org/uniprot/P02768上给出了已知的多态性的列表。重组人血清白蛋白的产生和纯化是完善的(W0 95/23857 ；WO 00/44772 ；WO 2006/066595 ；EP 0 305 216 ；Sle印等 1990 Biotechnology(N Y). 1990 Jan ；8(1) :42-6)) 并且包括用于药物应用的重组人血清白蛋白(Bosse等Q005).J Clin Pharmacol 45(1) 57-67)。HSA的三维结构已经通过X射线晶体学得到了阐明(Carter等(1989). Science 244 (4909) :1195-8 ;Sugio 等(1999). Protein Eng 12(6) :439-46)。HSA 多肽链具有 35 个半胱氨酸残基，其形成17个二硫键和一个在成熟蛋白(Seq ID No. 1)的34位的不成对 (游离)的半胱氨酸。半胱氨酸-34已经用于将分子缀合至白蛋白(Leger等O004)BiOOrg Med Chem Lettl4(17) :4395-8 ；Thibaudeau ^ (2005). Bioconjug Chem 16(4) :1000-8)， 并提供了精确的、明确确定的缀合用位点。然而，在半胱氨酸34处的缀合仅提供了一个用于附接单一模块的位点，因此对缀合位点没有选择。另外，提供单一缀合位点意味着只有一个模块能够与每个白蛋白分子缀合。需要的是提供一个或多个可供选择的附接位点的白蛋白分子。
技术实现思路
基于对人血清白蛋白(HSA)三维结构的分析，白蛋白多肽及其天然多态性中的保守残基，专利技术人设计了白蛋白的变体多肽(mutein)，其具有一个或多个能缀合的半胱氨酸残基。术语“硫代白蛋白”在本文用于描述包含一个或多个不成对的半胱氨酸残基的白蛋白变体，特别是其中所述不成对的半胱氨酸残基中的一个或多个不存在于白蛋白天然存在的变体中的白蛋白变体。因此，硫代白蛋白是“能缀合的白蛋白”。硫代白蛋白可以称作“白蛋白的半胱氨酸变体”。在本说明书全文中，术语“白蛋白”包括天然存在的白蛋白、白蛋白相关蛋白及其变体，如天然的和工程化的变体。变体包括多态性、片段如结构域和亚结构域、片段和/或融合蛋白。所述白蛋白可以与SEQ ID No. 1具有至少40，50，60，70，80，90，95，96，97，98， 99%相似性或同一性。因此，本专利技术的硫代白蛋白可以是任何这样的白蛋白的衍生物，或是基于任何这样的白蛋白。不成对的半胱氨酸残基可以由插入、缺失、取代、添加或延伸白蛋白序列来提供。本专利技术还涉及包含至少一个，例如2、3、4、5或6个，缀合配偶体(conjugation partner)如生物活性化合物和根据本专利技术的多肽的缀合物。本专利技术还提供用于设计能缀合的白蛋白的方法。附图简述附图说明图1是显示用于在人血清白蛋白(SEQ ID No. 1)中选择用于氨基酸取代、插入和缺失以供产生能缀合的半胱氨酸的位点的标准的表。图2是人血清白蛋白(SEQ ID No. 1 = Human_P02768. pro)与来自十五种其他哺乳动物物种的白蛋白的氨基酸序列的比对。“大多数”显示出共有序列。“+大多数”以条形图形式显示所有十六种序列之间的相对同源性，其中条形图的高度指明20、40、60、80和 100%的相对同源性。所述蛋白质序列包括前导序列。图3是人血清白蛋白(P02768. pro = SEQ ID No. 1)与来自三十二种其他物种(其中一些是哺乳动物)的白蛋白的氨基酸序列的比对。“大多数”显示出共有序列。“+大多数”以条形图形式显示所有三十三种序列之间的相对同源性，其中条形图的高度指明20、 40、60、80和100%的相对同源性。所述蛋白质序列包括前导序列。P02768.pro 人；P02769. pro 牛；P49064. pro 猫；P49822. pro 犬；Q5XLE4. pro 驴 JC5838. pro 沙鼠；ACF10391， 1. pro 山羊片段；AAQ20088. pro 豚鼠；P35747. pro 马；Q28522. pro 猕猴；P07724. pro 小鼠；P08835. pro 猪；P02770. pro 大鼠；P49065. pro 兔；Q28522. pro 恒河猴；P14639. pro 绵羊；NP_001127106. pro 猩猩；P19121. pro 鸡；P01012. pro 鸡卵清蛋白；073860. pro 火鸡卵清蛋白；AAC63407. pro 七腮鳗(sea lamprey) ；Q91274. pro 七腮鳗；P21847. pro :41 M ；AAD09358. pro =Rana shqiperica( ^yjfbKM ) ；ABXL68. pro(Xenopus)； ΝΡ_001004887. pro 爪蟾；AAL56646. pro 斑蝾螈(Spotted Salamander) ；Q03156. pro 大西洋鲑；P21848. pro 大西洋鲑；AAM46104. pro 楔齿蜥(Sphenodon punctatus) ；P83517. pro 澳洲肺鱼(Australian lungfish) ；S59517本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备能缀合的多肽的方法，包括：ａ）提供包含至少一例白蛋白序列的三维结构模型，并且任选地提供该白蛋白序列的氨基酸序列，ｂ）在所述白蛋白序列中选择氨基酸残基，其对应于相对所述模型的或所述氨基酸序列的序列的Ｎ端或Ｃ端的第１、２、３、４或５个残基或其在涉及三维结构模型的所述白蛋白序列的各种情况下满足以下条件：ｉ）至少８０％的溶剂表面可及性；ｉｉ）至少３０的Ｂ因子得分；ｉｉｉ）没有已知引起热不稳定性的多态性；ｃ）用半胱氨酸取代选择的残基或在选择残基的Ｎ端侧或Ｃ端侧插入半胱氨酸，ｄ）任选地，对所述白蛋白序列进行额外的变化，其中每个变化为氨基酸缺失、取代或插入；和ｅ）制备具有所得氨基酸序列的多肽。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：CJA芬尼斯，
申请(专利权)人：诺维信生物制药丹麦公司，
类型：发明
国别省市：DK
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