对小ＲＮＡ进行定量的方法技术

本发明专利技术涉及利用定量逆转录聚合酶链式反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）技术对微ＲＮＡ分子进行扩增和定量的方法。所述方法包括以下步骤：（ａ）利用多聚腺苷化和引物延伸通过逆转录来产生与样品微ＲＮＡ互补的ｃＤＮＡ分子和（ｂ）利用微ＲＮＡ特异的引物组通过ｑＰＣＲ对ｃＤＮＡ进行扩增和定量，所述微ＲＮＡ特异的引物组为包含ＬＮＡ单体的正向和反向引物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对小RNA进行定量的方法专利
本专利技术涉及利用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对小的非编码的RNA 分子进行扩增和定量的方法。专利技术背景微RNA是一类丰富的约22个核苷酸的非编码RNA，它们在动物、植物和病毒发育中起着重要的调节作用。差不多在15年前发现lin-4时就开始关注微RNA，lin_4编码的小 RNA在线虫(C. elegans)生命周期和幼虫发育中参与线虫的时控和进程(Lee et al. 1993 Cell 75 :843-854, Wightman et al. 1993 Cell 75 :855-862)，但是直到最近才意识到微RNA所形成的主要类别的核糖调控子在动物中具有广泛的调节作用(Lagos-Quintana et al. 2001 Science 294 :853-858, Lau et al. 2001 Science 294 :858-862, Lee and Ambros. 2001 Science 294:862-864)。自从那时，对微RNA的研究发生了重大变革，现在 miRBase 数据库 12. 0 版(http // 微 RNA. sanger. ac. uk/)包括 866 种人类微 RNA，并且 PubMed 数据库(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/)包括 3900 种微 RNA 相关的条款， 这反映了对微RNA的兴趣和关注。微RNA通过降解信使RNA靶标或阻碍其翻译在转录后水平参与基因表达的调控， 并且据推测约有30%的人类基因组受微RNA的调控。微RNA的重要性还在于其参与多种细胞过程，包括发育、生长和增殖、凋亡、分化和诸如癌症和糖尿病的多种人类疾病(http:// www. mir2disease. ors/)。最近的文章(Barbarottoet al 2008 Int. J. Cancer. 122 :969-977)中强调了微 RNA在癌症中的重要性，这篇文章概括了 miRNA参与人类癌症的主要模式因此，“ (i)在每类被分析的人类癌症中，miRNA均改变了 ；(ii)miRNA充当癌基因和肿瘤抑制物；(iii) miRNA的改变可导致易患癌症；(iv)miRNA谱型是癌症患者的新的诊断工具和(v)miRNA谱型代表癌症患者的诊断工具”。因此，对癌症患者细胞和体液中的微RNA进行表达谱分析和定量的方法意义重大。为了满足这个需求，本专利技术描述了为微RNA测定开发出的新的坚实且可靠的qRT-PCR测定。通过qRT-PCR程序来定量微RNA是非常具有挑战性的，这是由于微RNA小，仅为 21-25个核苷酸，这是正常用于PCR的引物的大小。Raymond et al. RNA. 2005 Nov ；11 (11) 1737-44，Gilad et al. PLoS ONE.2008 Sep 5 ；3 (9) :e3148 和 Sharbati-Tehrani et al. BMC Molecular Biology. 2008,9 :34公布了这个问题的解决方案。Raymond et al.描述的qRT-PCR测定包括基因特异的逆转录步骤以及随后利用含有锁核酸(LNA)分子的基因特异的正向引物和通用反向引物的STOR green qPCR步骤。Gilad et al.报道的qRT-PCR 测定包括多聚腺苷化步骤、非特异的逆转录步骤和qPCR步骤，该qPCR步骤涉及基因特异的正向引物、基因特异的iTaqMan引物和通用反向引物。Sharbati-Tehrani et al.开发的 qRT-PCR测定包括基因特异的逆转录步骤以及随后利用基因特异的正向引物和2条通用引物的 SYBR green qPCR 步骤。然而，目前的通过qRT-PCR来定量微RNA的技术不能满足当前微RNA测定的需要，当前的微RNA测定需要允许在密切相关的微RNA之间进行辨别的高特异性、高敏感度、低本底以及相对简单的方案。本专利技术的特征为对样品中的所有微RNA仅需要一步逆转录反应，此外，提供了一种具有不匹配特异性的极其敏感的PCR方法，可用来精确定量诸如微RNA的小RNA分子。专利技术概述为了建立和理解与诸如癌症的人类疾病相关的微RNA调节异常模式，需要新的改良的技术对人类细胞和体液中的微RNA进行检测和定量。为了本目的，本专利技术介绍了一种新的高度敏感和特异的测定。一方面，本专利技术提供了对样品中的微RNA分子进行扩增和定量的方案在本方案的第一步中，通过单管反应中两种酶的协同作用产生样品微RNA的互补DNA(cDNA)。首先， 利用poly㈧聚合酶使微RNA的3’-末端加上poly-A尾，其次，使延伸引物与poly-A尾杂交，并利用微RNA作为模板通过逆转录酶产生cDNA。所述第一步骤是非特异性的，并且产生样品中存在的所有微RNA的cDNA。在本方案的第二步中，在qPCR反应中利用微RNA特异的引物组对特定cDNA进行扩增和定量，所述微RNA特异的引物组的正向引物和反向引物包含 LNA单体。另一方面，本专利技术提供了表18列出的寡核苷酸引物(SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 128)。本专利技术的引物利用本专利技术方法可用来检测哺乳动物微RNA。另一方面，本专利技术提供了检测哺乳动物微RNA的试剂盒，所述试剂盒包括通用延伸引物和微RNA特异的正向和反向引物组，这些引物组用来对至少一种微RNA、微RNA子集或所有已知的微RNA进行定量。本专利技术可用于可靠且特异的定量微RNA测定，包括利用单一测定或自动平台上的高通量应用软件来诊断和预后疾病(例如癌症)的测定。利用本专利技术的方法可以分析从活有机体的各种细胞类型提取的含有RNA的样品，所述活有机体例如哺乳动物和植物以及包括受病毒感染的细胞。尽管本专利技术的主要目的为提供定量微RNA的方法，但是所述方法可用于检测和/ 或定量所有类型的RNA，尤其是所有类型的小的非编码RNA。附图图1显示本专利技术的特异的qRT-PCR所涉及的步骤。为了说明原理，以微RNA的 qRT-PCR为例，利用本方法分析的RNA还可以是任何其它小RNA分子或者甚至是mRNA。步骤1是用于样品中存在的所有微RNA的一管式反应。步骤2是利用特异微RNA的正向和反向引物所进行的微RNA特异的qPCR。椭圆形指示LNA插入正向和反向引物。当实际操作该方法时，首先利用poly(A)聚合酶使样品中存在的miRNA加上poly-A尾，所述poly(A)聚合酶将腺嘌呤残基添加到RNA分子的3’ -末端。其次，通过与延伸引物的VN-poly-T-序列(N = C、G、A和T ;V = C、G和A)的杂交，使该延伸引物与带poly-A尾的miRNA退火，所述延伸引物具有poly-Τ中央核苷酸序列、3’ -末端VN简并基序和5’ -末端尾。该引物可被称为通用RT引物。再次，延伸引物利用miRNA为模板在逆转录反应中被延伸。所有这些反应均在一管式反应中进行。得到的初级延伸产物由延伸引物和新合成的DNA组成，该产物是与样品中的所有miRNA互补的cDNA。下一步进行miRNA特异的PCR。miRNA特异的正向引物与新合成的cDNA的3’ -末端退火，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．扩增样品中特定ＲＮＡ分子的方法，所述方法包括以下步骤：ａ）向样品中ＲＮＡ分子群加ｐｏｌｙ－Ａ尾；ｂ）在逆转录反应中利用引物产生带ｐｏｌｙ－Ａ尾的ＲＮＡ分子的ｃＤＮＡ分子；以及ｃ）利用对所述特定ＲＮＡ分子特异的正向引物和反向引物通过ＰＣＲ扩增所述ｃＤＮＡ分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】DKPA2009001562009年2月2日1.扩增样品中特定RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤a)向样品中RNA分子群加poly-A尾；b)在逆转录反应中利用引物产生带poly-A尾的RNA分子的cDNA分子；以及c)利用对所述特定RNA分子特异的正向引物和反向引物通过PCR扩增所述cDNA分子。2.如权利要求1所述的方法，其中所述特定RNA分子是小的、非编码的RNA。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述特定小RNA分子是微RNA。4.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述延伸引物的长度范围为10-100 个核苷酸。5.如权利要求4所述的方法，其中所述延伸引物的长度范围为15-45个核苷酸。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述延伸引物为通式III的核苷酸序列R1-(T)y-R2(III)其中R1是5’ -末端的核苷酸序列，(T)y是中间部分y个连续的胸腺嘧啶残基，其中y 为1-100的整数，R2是3’ -末端的核苷酸序列。7.如权利要求6所述的方法，其中R1是长度为1-30个核苷酸的核苷酸序列。8.如权利要求7所述的方法，其中R1是长度为6-10个核苷酸的核苷酸序列。9.如权利要求8所述的方法，其中R1是长度为8个核苷酸的核苷酸序列。10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中y为5-50的整数。11.如权利要求10所述的方法，其中y为5-21的整数。12.如权利要求11所述的方法，其中y为12、13、14、15、16、17或18。13.如权利要求12所述的方法，其中y为15。14.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其中R2是由两个3’-末端核苷酸残基组成的序列基序VN，其中V是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，且N是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。15.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其中R2是由三个3’-末端核苷酸组成的序列基序VNN，其中V是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，且N是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述延伸引物包含至少一个LNA。17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述正向引物的长度范围为10-100个核苷酸。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述正向引物包含至少一个LNA。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述正向引物被设计成与靶RNA分子的互补DNA分子特异杂交。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述反向引物为通式II的核苷酸序列R3-(T)x-R4(II)其中R3是5’ -末端核苷酸序列，(T)x是中间部分χ个连续的胸腺嘧啶残基，其中χ为 1-100的整数，R4是与靶RNA分子的核苷酸序列特异杂交的3’ -末端核苷酸序列。21.如权利要求20所述的方法，其中R3是长度为1-30个核苷酸的核苷酸序列。22.如权利要求20或21之一所述的方法，其中χ为5-50。23.如权利要求22所述的方法，其中χ为5-21。24.如权利要求23所述的方法，其中χ为15。25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通式(II)的χ等于通式(III)的y。26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中R4的长度范围为1-10个核苷酸。27.如权利要求20-26中任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·坎波·巴斯克，
申请(专利权)人：埃克西库恩公司，
类型：发明
国别省市：DK