本发明专利技术是基于１１Ｅ１０抗体在Ｓｔｘ２蛋白中的表位的发现。本发明专利技术的特征在于组合物，其含有包含１１Ｅ１０单克隆抗体表位的非全长Ｓｔｘ２多肽。本发明专利技术的特征还在于生产抗－Ｓｔｘ２抗体的方法，所述抗－Ｓｔｘ２抗体对Ｓｔｘ２蛋白的１１Ｅ１０表位是特异性的。另外，本发明专利技术的特征在于使用包含１１Ｅ１０表位的多肽或使用通过本发明专利技术的方法开发出的抗－Ｓｔｘ２抗体治疗具有志贺毒素相关疾病（例如，溶血性尿毒症综合征和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病）或处于发展所述疾病风险中的受试者的方法。此外，本发明专利技术的特征在于使用通过本发明专利技术的方法开发出的抗体对样品中Ｓｔｘ２的检测。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
一般而言，本专利技术涉及治疗和预防志贺毒素(Shiga toxin)相关疾病的领域。
技术介绍
在美国，生成志贺毒素(Mx)的大肠杆菌(STEC)每年造成约110，000例感染。肠出血性大肠杆菌(EHEC)(最显著地是血清型0157:H7)是被发现产生Stx介导的疾病的 STEC的子集(subset)。生成Mx的生物体的感染的一种可能并发症是溶血性尿毒症综合征(HUQ，其特征在于溶血性贫血、栓塞性血小板减少症和肾衰竭。对于具有HUS的那些人而言，存在大约5-10%病死率，且幸存者可能具有持续的肾损伤。目前，没有FDA批准的用于减轻或预防由Mx-介导的疾病引起的疾病的疗法或疫苗，但是几个在将来有前途的选择包括结合和中和的人源化的单克隆抗体，和嵌合的ΜχΑ2/ΜχΒ1类毒素，其引起中和应答并提供对Mxl或或Mxl和Stx2的致死攻击(challenge)的保护。基本上存在Mx的2个主要类型Α χ/Μχ 和Mx2。Mx由痢疾志贺氏菌 (Shigella dysenteriae) 1型生成，而Stxl和Stx2由大肠杆菌生成。Stx和Stxl基本上相同，仅在A亚基中存在1个氨基酸差异。Mxl和的成熟的A和B亚基分别具有68%和 73%相似性。尽管存在氨基酸序列差异，Stx和的晶体结构非常类似(图1)。通过多克隆抗血清可以辨别这些毒素针对Mxl产生的多克隆抗血清不会中和Mx2，反之亦然。 存在 Stxl 和 Stx2 的变体，包括 Stxlc、MxlcUtx2c、Mx2cUtx2d-可活化的(Stx2_act.)、 Stx2e 和 Stx2f0志贺毒素是具有AB5结构的复杂的全毒素。活性结构域(A)含有将60S核糖体亚基的^S rRNA脱嘌呤化的N-糖苷酶，其终止蛋白合成，并最终导致细胞死亡。A亚基是 32kDa，且被胰蛋白酶(trypsin)或弗林蛋白酶(furin)蛋白水解性地切割成 ^kDa A1亚基和 5kDa A2肽，它们通过单个二硫键相连。A1亚基含有活性结构域，且A2肽将该活性结构域非共价地连接到结合(B)结构域上。(B)结构域由5个相同的 7. 7kDa单体组成，所述单体形成五聚体，A2肽的C-端贯穿该五聚体。B亚基单体中的每一个具有2个半胱氨酸残基，它们在每个单体内形成二硫键。B五聚体结合真核受体三聚己糖神经酰胺(三己糖基神经酰胺，globotriaosyl ceramide) (Gb3)(或 Gb4,如对于 Stx2e 的情况)。尽管已知暴露于这些毒素的结果，目前尚不存在对Mx-介导的疾病的已知治疗或疫苗。抗生素的使用可能通过增加细菌的毒素释放而加重该情况。因而，需要预防或治疗由志贺毒素造成的EHEC感染的并发症的化合物。这样的化合物可以用于治疗受感染的受试者，并减少毒素对中枢神经系统(CNS)、血液和肾的系统性作用。另外，如果可以中和毒素，可以安全地给予抗生素，以杀死胃肠(GI)道中的细菌。由于抗生素通过诱导携带毒素基因的噬菌体而增加毒素生成的可能性，STEC感染的抗生素治疗被禁忌。这样的化合物也可以用于预防感染的并发症，其通过在个体获得EHEC感染之前治疗暴露的或高危的个体而进行。这样的个体将包括日间住院医疗的儿童或在医护疗养所中的老年人，该处已经鉴别出EHEC腹泻的病例。这些个体处于发展EHEC感染的高危中，经常具有严重的并发症，且EHEC在这些环境中的传播并不罕见。
技术实现思路
单克隆抗体11E10会识别的A亚基，并中和它的细胞毒性。尽管MxAl和 MxA2之间存在68%氨基酸(aa)序列相似性，11E10单克隆抗体不会结合MxAl。我们已经发现，11E10表位包括跨MxA2单体上的3个区域的不连续的或构象的表位。发现3个不同性区域在Stx2A亚基的晶体结构上的位置彼此邻近，所述3个不同性区域包括氨基酸 42-49 (SEQ IDNO 1) ,96-100 (SEQ ID NO 2)和 244-259 (SEQ ID NO :3)。因此，我们已经发现，11E10表位包括以SEQ ID NO :1、2和3示出的序列中的至少1个、2个或所有3个。因此，本专利技术的特征在于一种多肽，其包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的氨基酸序列的至少1个、2个或3个，其中所述多肽不是全长Mx2。所述多肽至少包括在SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列。理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1和2中所述的氨基酸序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的氨基酸序列。在一个实施方式中，在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的一个或多个被插入非-Stx2蛋白支架(protein scaffold)中。在某些实施方式中，所述蛋白支架是与Mxl或其片段基本上相同的蛋白， 例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%相同。在一个实施方式中，所述蛋白支架是^^、Stx或携带一个或多个保守点(位点，point)突变的 Mxl。在另一个实施方式中，本专利技术的多肽包括与在SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述多肽可以包括的片段，其包括SEQ ID N0:l、2或3;SEQ ID NO :1和2;或SEQ ID NO :1、2和3，例如，Stx2多肽序列的氨基酸四-297、氨基酸1-158或氨基酸，其中所述片段不是全长Mx2。在有些实施方式中， 所述片段被插入蛋白支架(例如，Stx或Mxl)中。本专利技术的特征还在于一种多肽，其包括与在SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列的片段基本上相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述片段包括与SEQ ID NO :8的氨基酸 64-122 至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 相同的序列，且另外至少包括在SEQ ID NO :1中所述的氨基酸序列。优选地，所述片段另外包含在SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :2和3中所述的(一个或多个)氨基酸序列。所述片段的长度可以是，例如，20、40、59、60、150、200、219、236、250、300或314个氨基酸。在某些实施方式中，所述多肽被类毒素化。所有上述多肽都被包括在术语“本专利技术的多肽”内。本专利技术也包括编码任一种本专利技术的多肽的核酸分子，包括其中所述核酸被连接到载体中的表达构建体上，且其中该载体被插入宿主细胞中。在一个有关的方面，本专利技术的特征在于一种用于使用任一种本专利技术的多肽刺激针对的免疫应答的组合物。理想地，所述多肽包括在SEQ IDNO :1和2中所述的序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的序列。在这些实施方式的任一个中，所述组合物可以另外包括佐剂(adjuvant)。在某些实施方式中，所述组合物不会刺激针对Mxl的免疫应答。本专利技术的特征还在于任一种本专利技术的多肽(例如，蛋白支架如Stxl，其插入了在 SEQ ID N0:l、2或3中的至少1个、2个或所有3个中所述的氨基酸序列)的应用。这样的肽可以用于针对任意志贺毒素有关的疾病进行免疫或治疗，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于刺激针对Ｓｔｘ２的免疫应答的组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和至少一种纯化的多肽，所述多肽包含：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和２；或（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２和３；以及非－Ｓｔｘ２蛋白支架，其中，所述ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和２、或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２和３插入到所述非－Ｓｔｘ２蛋白支架中，其中，所述多肽具有Ｓｔｘ２的抗原性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾利森·奥博莱，
申请(专利权)人：杰克孙M亨利基金会先进军事医学有限公司，
类型：发明
国别省市：US
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