测定去抑制后酶活性的方法和设备技术

本发明专利技术涉及一种测定样品中酶活性的方法，该样品含有至少一种酶和至少一种与所述酶相对应的酶抑制物，测定去抑制后释放的酶活性方法如下：在样品中加入底物，记录至少一种反应产物（酶切产物）浓度随时间的变化，其中所述酶的特异性底物所含的荧光部分在该酶反应中被切断，可检测其荧光（测定参数），即检测设定的与要检测的酶活性明确相关的波长范围；所述去抑制是通过在样品中浸入结合有抑制物结合基质的刚性载体而实现。本发明专利技术还涉及测定样品中酶活性的相应设备。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测定去抑制后酶活性的方法和设备本专利技术涉及测定去抑制后的酶活性，具体是测定蛋白水解酶，主要是测定在恶性肿瘤诊断和治疗中至关重要的半胱氨酸蛋白酶活性的方法和设备。样品中存在酶与抑制物的复合物，在体内蛋白水解酶的活性主要通过与抑制物结合而受到抑制。类似的论题可参见W097/00969中所述。另外，德国专利申请10 2007 017 681. 5涉及类似的专利技术，还有德国专利申请10 2007 057 388.1和10 2007 034 120. 7，它们所公开的全部内容通过引用纳入本文。根据现有技术，已知此类酶活性的测定主要受到样品中抑制物的抑制，酶活性的测定方法是，先使样品通过柱流穿，除去样品中抑制该酶的抑制物。然后，将无抑制物的酶加到检测容器中，加入合适的底物后，通过反应期间至少一种酶切产物浓度的提高来测定该酶的活性。本专利申请的目的是提供测定去抑制后酶活性的方法和设备，实现了检测灵敏度的显著提高和更高的可靠性，这样就不再需要为获得生物样品而进行手术干预，因为现在可用血清替代生物样品。另外，本专利技术提供的测定去抑制后酶活性的方法和设备，适合执业医师或小规模医学实验室的每日日常工作，或急诊病例，其操作相当简便，能提供足够准确的结果，特别是费用低而有效，可作为预后要素(决定疗法)或作为预后指标(诊断目的)。采用权利要求1所述的测定去抑制后酶活性的方法和权利要求10所述的测定去抑制后酶活性的设备可实现该目的。其它实施方式和其它添加内容出自从属权利要求。为了测定去抑制后的酶活性，优选荧光底物其中7-氨基-4-甲基香豆素，作为荧光物质与寡肽，优选二肽的C-末端结合，其N-端用羧基苄基保护基团保护(缩写为Cbz或 Z)。然而，某些情况下，明确地说，测定结果不够准确。C-末端用7-氨基-4-三氟甲基香豆素代替7-氨基-4-甲基香豆素，可使切下的荧光物质的发射光迁移到更长的波长，从而可在该波长范围内检测酶切下的荧光物质的荧光，而样品中其它要检测的发光物质不会再干扰其测定结果，从而实现灵敏度更高的酶活性检测，特别是用普通设备和方法时。如果生物样品是(例如)组织样品或组织勻浆，采用旁路法，可检测样品通过旁路后样品中原先不受抑制的半胱氨酸蛋白酶的那部分酶活性。已知组织勻浆中要测定的是受抑制的蛋白酶而不是所有酶，这只是其中的一部分酶。因此，测定两次酶活性，即生物样品通过亲和层析柱后和通过旁路后两次测定值的差异，提供了生物样品中原先受抑制的酶活性。本专利技术所测定的发射荧光的波长范围约为500nm至以上。以下附图显示附图说明图1显示本专利技术第一个实施方式测定去抑制后酶活性所用的设备。图2显示与图1设备相比功能改进的设备，它几乎是半自动化设备。图3显示本专利技术另一个实施方式测定去抑制后酶活性所用的设备。在图1和图2中，模块A为平面剖视图，模块B为立体图。在附图描述中，对于相同或功能相同的部件采用相同的数字。图1显示本专利技术第一个实施方式测定去抑制后酶活性所用的设备。可替换亲和层析柱1包封在配备至少一个珀耳帖(Peltier)元件的恒温器2内。 柱1是圆柱体，充填有多孔基质凝胶载体，该载体基质结合酶抑制物复合物中的抑制物比酶更牢固。因此，酶被释放，可测定其活性。可替换注射器4的尖端8可伸入柱1的上部开口 3内，优选在柱1的下端安装关闭阀门6，注射器4内装入体积5含酶与抑制物复合物的样品。当垂直推压注射器4时，体积5实际变为0，内含物进入装有载体(优选紧密装填) 的柱1中。然后用第二注射器7将体积为样品体积约100-103倍的洗脱缓冲液全部或部分加入柱1中。第一种方法如下取样品与一部分洗脱缓冲液一起在柱1中，于确定的适当温度 (例如约4°C)下培育一段时间，具体约10-18分钟。15分钟特别有效。然后，用注射器7 进一步加入洗脱缓冲液，洗脱游离的酶，当打开阀门6时，洗脱液向下流入图1的模块B中。在第一种方法中，先打开阀门6直到一部分柱缓冲液进入柱1内，或直到样品分散到整个柱长内。此时，可不考虑计量排放(例如图2所述，通过排水管28)体积。培育后， 打开阀门6进行洗脱，然后关闭阀门，残留体积不会损害测量值。该残留体积也可通过排水管28排放。在第二种备选方法中，样品与加入的柱缓冲液一起向下流过该柱，流速应确保样品中所有酶抑制物复合物中的抑制物能转移到柱中的固定基质上，该基质与抑制物的结合比与酶的结合更牢固。这几乎是一种迁移性培育。如此，游离的酶被洗脱，洗脱液向下流入图1的模块B中。在该方法中，开始时也排出一定体积(如图2所述，通过排水管观)；当流过几乎最佳测定体积后，也同样排出一定体积。因此，图1的模块A是基本上位于检测盒模块B上方的去抑制设备，柱1排放的体积经管道或管线，通过盖板11排入荧光比色杯10。(盖板11涂成黑色可吸收通过测定样品的激光)。游离的酶在该酶试验中作用是蛋白酶水解酶，将加入比色杯10中的底物切下一个片段，该游离片段可产生荧光。随着时间的推移荧光强度增强，可在确定的适当温度下 (通过珀耳帖元件19调节)测定所释放酶的酶活性。在下方的检测盒(模块B)中，安置有用于激发荧光的激光二极管。该激光二极管能发射与所述底物荧光片段最大激发光相对应波长的光。光二极管17可发射与激光束方向正交的荧光14。流线式滤器15和干涉滤光片 16可滤去激发光中的几乎所有散射光，确保只有荧光到达光二极管17。调整模块A中亲和层析柱1的温度，控制在3-20°C，优选4_5°C范围，由于抑制物与柱内的亲和层析填料结合而使蛋白水解酶释放并且可能消化其自身，即在较高温度下一个蛋白水解酶分子可能攻击另一个酶分子。控制温度于37°C (对于人医学目的，为此目的可用另一个设备控制温度，也可用珀耳帖元件恒温器19)测定模块B中的酶活性。然而，也可在20°C或环境温度下测定酶4活性，但在整个测定时间内必须保持每种所选温度稳定。在最基础情况下，比色杯10的实施方式也是一次性使用器材。(开始时，杯中装有测量缓冲液和酶试验用成分)。然而，也可将混合液直接加入到比色杯10中，或由于情况不同，可利用另一阀门和泵经管道9加入混合液，如需要还可加入合适的测定缓冲液。洗脱完成后，加入底物液开始酶反应。如图2所示，从底物液容器18经阀门沈，或如图1所示，通过注射器(未显示)经盖板11加入底物液。部件1、5、4、10都是廉价的一次性使用器材。可替换部件的优点是一个病人样品的任何部分都不会与另一病人的样品接触。必需考虑加到柱1中的一个病人的体液样品在洗脱过程中主要是想让酶抑制物留在柱中；然而，并不清楚是否其它成分也会留在柱中。在任何情况下，荧光比色杯10中的样品不仅含有游离酶，而且含有原始体液的大部分其它成分。此观念的另一个好处是不需要复杂的机械部件，例如阀门/泵。用测定缓冲液稀释洗脱液对于获得良好测定结果有利，可能是必需的。靠近检测比色杯的激光二极管和/或光二极管可导致检测范围提高。图2显示与图1相比功能有所改进的设备，几乎是半自动化设备，然而柱1可如图 1所示在两种方法中都可操作。因此，在柱1的上下两端装有多通路阀门22和沈。设备的各部件也可以按图1所示安装。图2也是亲和层析柱1，附带温度控制单元6 (即珀耳帖元件)，优选调节到4°C。 柱中紧密填充有基质材料，能高亲和力结合感兴本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种测定样品中酶活性的方法，该样品含有至少一种酶和至少一种与所述酶相对应的酶抑制物，测定去抑制后释放的酶活性方法如下：在样品中加入底物，记录至少一种反应产物（酶切产物）浓度随时间的变化，其中所述酶的特异性底物所含的荧光部分在该酶反应中被切断，可在与要检测的酶活性明确相关的波长范围内检测其荧光（测定参数）；其特征在于，所述去抑制是通过在样品中浸入结合有抑制物结合基质的刚性载体而实现。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·W·霍夫，
申请(专利权)人：帕普斯特许可有限两合公司，
类型：发明
国别省市：DE