利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法。本发明专利技术所述的方法包括丁二酸生产菌的菌种活化、种子培养及发酵培养产丁二酸的步骤，其技术要点在于发酵培养产丁二酸的步骤包括超声处理蔗渣、用稀酸水解方法制备多组分糖液、将备用碳源直接添加至不含碳源的发酵培养基中、节省氮源用量、接种产酸的步骤。采用该方法发酵制备丁二酸能进一步降低蔗渣纤维水解糖液的制备成本，还能用蔗渣替代部分昂贵的氮源，解决了传统发酵产丁二酸原料成本高的技术问题，又实现了高效利用可再生资源、对环境友好等优点，展现出其美好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种。
技术介绍
丁二酸，俗称琥珀酸，作为一种常见的天然有机酸，广泛存在于动植物和微生物中，许多厌氧微生物以丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为一种优秀的C4平台化合物，丁二酸可被广泛用于药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物前体，如可作为 1，4-丁二醇、四氢呋喃、脂肪酸、Y-丁内酯等的中间物，而这些化学制品都具有很大的市场潜力。在粮食短缺的威胁下，探索木质纤维素原料生产丁二酸成为化工原料发展战略的重要组成，也是研究的热点。木质纤维素原料是自然界分布最广、含量最多、价格低廉，而又未得到充分利用的可再生资源。我国目前南方蔗区有近2000万亩甘蔗种植面积，南方蔗区尚有1000万亩宜蔗面积可种植能源甘蔗，发展后甘蔗种植面积可达3000万亩。蔗渣纤维的产量将达到3000万吨，利用蔗渣纤维原料生产丁二酸，可大大缓解蔗渣原料浪费的局面。由于蔗渣的原料较为集中的优点，利用甘蔗渣等纤维质原料生产丁二酸的研究和开发目前是国内外寄予厚望的重点方向，对改善国家能源结构，缓解国家能源危机，保障国家能源安全和粮食安全，积极开发与利用“低碳经济”与“低碳能源”，为社会发展提供可持续、可再生、绿色、清洁能源，推动社会经济走上持续、健康的循环经济发展道路具有十分重要的眉、ο在利用微生物进行丁二酸发酵生产的过程中，碳源作为原料中的主要成分对微生物的生长代谢起到了至关重要的作用，几乎参与微生物代谢的各个方面。而碳源成本在发酵成本中占据着举足轻重的地位，如何降低碳源的成本，也是微生物发酵领域密切关注的焦点。蔗渣中含有30% 35%的半纤维素成分，将此成分通过水解，可转化为被微生物利用的碳源，除此之外，由于蔗渣纤维水解液的成分比较复杂，其中还含有部分碳源，恰好可以取代发酵培养基中部分氮源，而氮源也是较昂贵的原料，利用蔗渣原料发酵制备丁二酸，将使得生物法制备丁二酸更具经济性。
技术实现思路
本专利技术的技术目的是提供一种新的利用蔗渣作为碳源甚至替代部分氮源来发酵制备丁二酸的方法，使得采用该方法发酵制备丁二酸能进一步降低蔗渣纤维水解糖液的制备成本，还能用蔗渣替代部分昂贵的氮源，解决了传统发酵产丁二酸原料成本高的技术问题，又实现了高效利用可再生资源、对环境友好等优点，展现出其美好的工业应用前景。为了实现本专利技术的技术目的，本专利技术的技术方案如下。—种，包括丁二酸生产菌的菌种活化、种子培养及发酵培养产丁二酸的步骤，其特征在于发酵培养产丁二酸的步骤如下(1)超声处理蔗渣，使其中糖分处于更有利水解的状态将蔗渣与稀硫酸按照质量体积比(w/v)15 20%混合，超声的时间为20 60 min，超声温度为15 25°C，超声频率为 80-150 赫兹。进一步地，所述的稀硫酸的体积含量为1% m (ν/ν)。(2)用稀酸水解方法制备多组分糖液将步骤(1)得到的料液加热至温度120 1300C，水解150 180min后经抽滤得到水解液，调节pH至6. 0，115°C灭菌15min后作为碳源备用。(3)将备用碳源直接添加至不含碳源的发酵培养基中，接入种子培养后得到的种子液。进一步地，所述的不含碳源的发酵培养基配方为富马酸二钠1，KH2P04 3， MgCl2·6Η20 0.3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，ρΗ 7· 0，121°C灭菌 15 min。(4)向步骤(3)的发酵培养基中添加氮源氮源的用量为原氮源需要量的0 80%。 进一步地，所述的氮源的优化用量是原氮源需要量的60 80%。所述的氮源应理解为现有技术中任何发酵产丁二酸所使用的氮源，在本专利技术中包括但不限于酵母粉、蛋白胨、玉米浆或豆饼粉。(5)将丁二酸生产菌的种子培养液直接接种至步骤(4)的培养基中，发酵制备丁二酸。进一步地，所述的发酵培养条件为厌氧，发酵温度30 40°C，发酵时间36 72 h ；接种量为10 15%。本专利技术所述的丁二酸生产菌应理解为现有技术中任何产丁二酸的微生物菌株，例如在本专利技术是所述的丁二酸产生菌包括但不限于产琥珀酸放线杆菌，大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，或曼海姆氏产琥珀酸菌。本专利技术所述的菌种活化的步骤应理解为现有技术中任何的对丁二酸生产菌的菌株活化方法；所述的种子培养的步骤也应理解为现有技术中任何的对丁二酸生产菌的种子培养方法，而不应受本专利技术的具体实施方式中的限制。本专利技术的有益效果在于本专利技术将蔗渣通过特殊时间和频率的超声处理后，又经过稀酸水解得到了多组分的糖液，而该糖液不需要经过脱毒处理，进行灭菌后加入不含碳源的发酵培养基中直接发酵微生物产丁二酸，一方面利用超声方法得到蔗渣中更多的糖分来进行微生物发酵制备丁二酸；另一方面，因为丁二酸菌株本身的特性，直接利用未脱毒的水解糖液发酵效果更好，更进一步简化了传统水解糖分作为碳源需要脱毒的复杂的工艺手续和成本；再者，蔗渣中含有30% 35%的半纤维素成分，将此成分通过水解，可转化为被微生物利用的碳源，除此之外，由于蔗渣纤维水解液的成分比较复杂，其中还含有部分碳源，恰好可以取代发酵培养基中部分氮源，而氮源也是较昂贵的原料，利用蔗渣原料发酵制备丁二酸，将使得生物法制备丁二酸更具经济性；此外对改善国家能源结构，缓解国家能源危机，保障国家能源安全和粮食安全，积极开发与利用“低碳经济“与“低碳能源"，为社会发展提供可持续、可再生、绿色、清洁能源，推动社会经济走上持续、健康的循环经济发展道路具有十分重要的意义。具体实施例方式以下实施例对本专利技术做了详细说明，但对本专利技术的应用并无限制。以下是实施本专利技术所采用的现有技术中的一些方法和培养基配方的一般性说明。1、菌种活化。斜面培养基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2PO4CH2O 9.6， K2HPO4·3Η20 15. 5，琼月旨 20，ρΗ 7· 0，121°C 灭菌 15 min。菌种活化方法菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37°C厌氧培养箱中活化培养M h;种子培养活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37°C培养10 12 h后作为种子液。2、种子培养。种子培养基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2PO4CH2O 9.6, K2HPO4·3Η20 15. 5, ρΗ 7· 0，121°C灭菌 15 min。种子培养方法将平板培养的菌种转接到装有50 mL种子培养液的100 mL血清瓶中，摇床转速120 r · min"1, 37 °C下培养10 h。3、发酵罐培养。将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为5 10 %，ν/ν,(体积比)搅拌转速为200 rpm，37°C发酵培养，CO2通气量为0. 25 vvm。多组分糖液中总糖含量的检测采用改进3，5- 二硝基水杨酸比色法(又称改进 DNS 法)。实施例1本实施例说明本专利技术所述的利用蔗渣发酵制备丁二酸的发酵培养产丁二酸的步骤。(1)超声处理蔗渣，使其中糖分处于更有利水解的状态将蔗渣与稀硫酸按照质量体积比(w/v) 15 20%混合，超声的时间为20 60 min,超声温度为15 25°C，超声频率为80-150赫兹。进一步地，所述的稀硫酸的体积含量为1% m (ν/ν)。(2)用稀酸水解方法制备多组分糖液将步本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　一种利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，包括丁二酸生产菌的菌种活化、种子培养及发酵培养产丁二酸的步骤，其特征在于发酵培养产丁二酸的步骤如下：（１）超声处理蔗渣，使其中糖分处于更有利水解的状态：将蔗渣与稀硫酸按照质量体积比（ｗ／ｖ）１５～２０％混合，超声的时间为２０～６０　ｍｉｎ，超声温度为１５～２５℃，超声频率为８０－１５０赫兹；（２）用稀酸水解方法制备多组分糖液：将步骤（１）得到的料液加热至温度１２０～１３０℃，水解１５０～１８０　ｍｉｎ后经抽滤得到水解液，调节ｐＨ至６．０，１１５℃灭菌１５ｍｉｎ后作为碳源备用；（３）将备用碳源直接添加至不含碳源的发酵培养基中，接入种子培养后得到的种子液；（４）向步骤（３）的发酵培养基中添加氮源：氮源的用量为原氮源需要量的０～８０％；（５）将丁二酸生产菌的种子培养液直接接种至步骤（４）的培养基中，发酵制备丁二酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，奚永兰，戴文宇，张九花，徐蓉，陈可泉，韦萍，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84