本发明专利技术公开了一种基于量子点的免疫荧光检测恩诺沙星的方法及专用试剂盒。本发明专利技术提供的用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒，包括恩诺沙星包被原和量子点标记的恩诺沙星抗体。本发明专利技术方法能实现对恩诺沙星残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明专利技术在恩诺沙星的检测领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于量子点的免疫荧光检测恩诺沙星的方法及专用试剂盒。
技术介绍
恩诺沙星(Enrof loxacin，ENR)，是喹诺酮类抗菌药，因其能抑制细菌DNA螺旋酶， 抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促进生长。由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日本及我国均制定了在组织中的最高残留限量。目前，用于恩诺沙星残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其样品前处理过程繁琐费时，检测费用高。基于竞争性酶联免疫反应原理的 ELISA方法不需进行复杂的样品前处理过程，检测时间相对短，但其精度不够，只能用于定性筛查，无法用于定量确证。当前出口水产品等农产品中检测恩诺沙星残留及其污染状况调查的样品数量大，任务重，花费高，检测周期过长。因此，急需检测结果稳定、快速、经济的标准方法。量子点(Quantum Dots, QDs)标记材料是近年来发展起来的一类新型材料，包括 II-VI族和III-V族半导体纳米晶。由于量子点突出的发光和吸收特性，使其具有荧光寿命长、宽激发光谱、窄发射光谱、可精确调谐的发射波长、很高的光化学稳定性、可进行多色标记等优越特性，采用其作为标记材料，可实现对靶标分子的超微量检测。由于适用于免疫诊断试剂的量子点标记材料必须满足量子产率高、荧光强、生物相容性好、高度稳定及成本低等要求，而现行国外商业化的量子点其量子产率多在40%以下，其尺寸偏小，需要用激光光学仪器来照射激发，目前仅能应用在细胞免疫荧光检测和流式细胞检测和分选等方面，因此国际市场上还没有量子点免疫检测试剂问世。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒。本专利技术所提供的用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒，包括恩诺沙星包被原和量子点标记的恩诺沙星抗体。上述试剂盒中，所述恩诺沙星抗体为抗体效价为IO6以上(具体为IO6)、抗体亲和常数为IO6 IO8M-1或IO7 IO8M-1或IO8M-1的恩诺沙星单克隆抗体；具体为抗体效价为106、 抗体亲和常数为IO8M-1的恩诺沙星单克隆抗体，所述恩诺沙星单克隆抗体购自北京圣迪隆生物科技有限公司，产品目录号为ENX-088。所述量子点为表面羧基含量为IX 10_3 9X 10-3mmol/mg或1 X 10_3 6X 10_3mmol/mg或5X 10_3mmol/mg的水溶性CcKe/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40 70%或50 70%或60% ；所述量子点的激发光波长为345nm，发射波长是 620nmo上述任一所述试剂盒中，所述量子点的粒径为10 20nm，所述粒径具体为13 20nm，所述粒径尤其优选为20nm ；其粒径的偏差(CV)在10 30%之间，具体为10 20% 之间，再具体为15% ；上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的恩诺沙星抗体中，所述量子点上的羧基与所述恩诺沙星抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述恩诺沙星抗体连接。上述任一所述试剂盒中，所述恩诺沙星包被原为恩诺沙星与载体蛋白的偶联物， 其中所述恩诺沙星与所述载体蛋白通过恩诺沙星中的羧基与载体蛋白中的氨基形成的肽键而连接；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白原和兔和鸡的丙种球蛋白中的任一种。上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中还包括恩诺沙星标准品、稀释液、洗涤液、 含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；所述恩诺沙星标准品为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸；所述稀释液为PBS缓冲液；具体为0. 02M、pH7. 4的PBS缓冲液。所述洗涤液为PBST缓冲液；具体按照如下方法制备取0. 2ml TWeen20及0. Ig的 Na 溶于所述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；具体为0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液。所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液；所述用于包被的蛋白为BSAjP 清蛋白和血蓝蛋白中的任一种。具体按照如下方法制备将IOg BSA和0. 2mlTween20溶于上述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。上述任一所述试剂盒中，所述标准品为如下溶液形式的标准品用所述稀释液将所述1-环丙基-7- (4-乙基-1-哌嗪基)-6"氟-1，4- 二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸稀释成如下各个浓度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10ug/L。上述任一所述试剂盒中，所述恩诺沙星包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述恩诺沙星包被原得到10μ g/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的恩诺沙星抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中将每25ug所述量子点标记的恩诺沙星抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。本专利技术的另一个目的是提供一种检测样品中恩诺沙星的方法。本专利技术所提供的检测样品中恩诺沙星的方法，包括如下步骤用上述任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样、饲料、蜂蜜或牛奶样本。所述待测样品具体为猪尿。本专利技术检测方法的原理采用量子点作为荧光信号标记分子，将恩诺沙星抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，加入恩诺沙星标准品或检测样品，以及量子点标记的恩诺沙星抗体，使其形成抗原-抗体二元发光免疫复合物，用荧光检测仪激发并检测该免疫荧光复合物的荧光强度，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测恩诺沙星的浓度。抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是加入量子点标记的恩诺沙星抗体后，包被的恩诺沙星抗原与检测样品中的恩诺沙星竞争性地结合恩诺沙星抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物。抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是同时加入量子点标记的恩诺沙星抗体及检测样品后，包被在聚苯乙烯微孔中的恩诺沙星抗原与检测样品中的恩诺沙星竞争性地与恩诺沙星抗体结合，其中与检测样品结合剩余的恩诺沙星抗体与包被在微孔板中的恩诺沙星抗原发生特异结合后形成固定在微孔板中的抗原-抗体二元免疫复合物。本专利技术的恩诺沙星免疫荧光检测试剂与量子点标记的免疫荧光检测技术相关，是采用量子点作为荧光信号标记材料，进行免疫荧光定量测定的一类方法，该技术整合了荧光量子点纳米材料化学合成、表面修饰及标记技术、间接竞争式免疫检测技术等相关领域的研究。本专利技术之所以能检测恩诺沙星，在于采用了一种基于量子点标记的免疫荧光定量测定的方法，即将恩诺沙星抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，基于量子点标记的间接竞争免疫荧光检测法的测定原理，在加入恩诺沙星标准品或检测样品，以及量子点标记的恩诺沙星抗体后，通过检测结合到聚苯乙烯板微孔中的抗原-抗体二元免疫复合物的荧光强度来实现对恩诺沙星的检测结合到聚苯乙烯板微孔的量子点标记抗体的数量不同，所产生的荧光强度也不同。在一定浓度范围内荧光强度值的高低与样品中的恩诺沙星的含量成反比。通过添加不同浓度的恩诺沙星标准品可制成标准曲线，根据此标准曲线查询各检测样品的荧光强度值可得到对应的恩诺沙星药物的浓度值。其具本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒，包括恩诺沙星包被原和量子点标记的恩诺沙星抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马岚，袁航，吴峰，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：94
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