一种从混合植物甾醇中分离制备甾醇单体的方法技术

本发明专利技术公开了一种从混合植物甾醇中分离制备甾醇单体的方法。该方法利用高效液相色谱，在反相半制备型高效液相色谱柱上循环进样和等度洗脱，分离植物甾醇混合物，对所分离的各个馏分，即植物甾醇单体分别收集，再经减压蒸馏去除溶剂后，得白色结晶或粉末状物质。本发明专利技术经多次进样可实现对多种植物甾醇单体从毫克级到克数级的分离制备。本发明专利技术对于包括植物甾醇在内的天然产物纯品的提取方面具有重要的理论及实际意义，将在植物的分析化学、精细化工中发挥重要作用，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化工或者精细化工领域，具体涉及一种从混合植物留醇中分离制备多种留醇单体的方法。
技术介绍
天然植物留醇是一类存在于植物中的天然活性物质，是以环戊烷全氢菲为主体骨架(甾核)的留体化合物，C_3i3位为醇羟基，环结构上通常有双键，在结构上与胆固醇相似。根据双键位置在留核环结构上的C5-C6位和C7-C8位不同，可以将它们分为Δ5-植物甾醇和△ 7-植物留醇等大类，而由于侧链的细微差别或C4位是否有甲基也代表了不同的植物留醇。可以说，官能团或化学键的不同，使植物留醇单体的化学结构复杂而多样。已从植物中鉴定出了近百种植物留醇及相关衍生物，其中谷留醇(β-Sitosterol)、豆甾醇 (Migmasterol)、菜油甾醇(Campesterol)和菜籽甾醇(Brassicasterol)相对含量较多。 从化学结构上看，谷留醇比菜油留醇在支链上多一个CH2基团，豆留醇比菜籽留醇在支链上多一个CH2基团，菜籽留醇和豆留醇在支链上均含有一个双键。植物留醇化学结构只有细微差别，导致了目前对它们的分离分析和纯化的困难。植物留醇具有十分重要的生理功能，β -谷留醇具有类似氢化可的松和羟基保泰松的功能，有较强的抗炎作用；植物留醇对治疗溃疡性皮肤鳞癌有明显功能，并且对血栓症有预防作用。植物留醇除了在药物上的应用外，最为引人注目的是其具有降低胆固醇吸收的功效，并可有效降低血清中低密度脂蛋白(LDL-C)水平。基于植物留醇对人体的诸多功能及其特有的性质，植物甾醇已在医药、食品、化妆品及饲料等行业中得到了广泛的应用。目前市场上销售的为甾醇混合物和2-3种Δ 5-植物甾醇单体(见Sigma-Aldrich 产品目录，包括克数级豆留醇、毫克级谷留醇、以及纯度为60%的毫克级菜油留醇，且价格较贵)，其他高纯度Δ5-植物留醇单体和所有的△ 7-植物留醇单体均无市售产品。我国对植物留醇的研究现在大多只停留在对总植物留醇的提取和分析方面，对其活性成分的具体研究及应用鲜有报道。特别是对植物留醇单体的研究，国内尚不多见。随着国内外对甾醇研究的日益关注和快速进展，植物留醇的药用价值越来越受到人们的重视。国外利用高品质的留醇开发研究出许多高档的药物，对高纯度留醇单体的需求量大幅上升。这主要是因为(1)结构的不同使不同留醇的功能也有一定的差异。例如谷留醇具有明显的抗炎性，可用于皮肤溃疡和皮肤肿瘤；而豆留醇具有一定的表面活性作用，可用作制备液晶的乳化助剂、无刺激保湿剂及营养剂和调理剂等，还可根据需要用于各种适宜所需的地方。(2)不同甾醇的功效可能会相互影响。例如，有报道称，菜油甾醇会降低谷甾醇的降胆固醇的作用， 因而要求在谷甾醇的产品中菜油甾醇的最大含量要小于40%。(3)合成的需求。目前在以甾醇为前体合成药物时，要求单个留醇具有较高的纯度以利于控制反应的条件及产品的性质和疗效。国外发达国家十分重视天然留体(植物留醇)资源的开发利用，重视食用油工业生产中脱臭馏出物等工业废弃物的综合利用，不仅原料来源稳定，而且价格相对便宜，在产品竞争上具有很大的优势。因此，如何将混合植物留醇分离成留醇单体产品，并提高其纯度和收率，是当前植物留醇分离精制研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从混合植物留醇中分离制备植物留醇单体的方法，可以快速同时获得多种不同结构的高纯度植物留醇单体。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下一种从混合植物留醇中分离制备留醇单体的方法，包括以下步骤①将植物留醇混合物完全溶解于丙酮中，室温冷却至结晶析出，抽滤并干燥；②将步骤①所的产物溶解于乙腈中，进样入高效液相色谱柱，以乙腈/异丙醇/水作为流动相，对混合留醇中的各化合物实现基线分离，对各单峰分别进行回收；多次循环进样，分别回收相同馏分的各单峰物质于相应回收瓶中；③旋转蒸发去除各馏分中的溶剂，得最终产品。所述步骤①中的植物甾醇混合物与丙酮的质量体积比1 :5 1 :10克/毫升，用 5(T60°C丙酮完全溶解甾醇混合物后，室温冷却6 12小时，有针状结晶析出，抽滤并干燥结晶，得白色针状或粉末状留醇混合物。所述步骤②中的植物留醇混合物室温溶解于有机溶剂乙腈中，质量体积比1 0. 5^1 2毫克/毫升，视混合留醇在乙腈中的溶解度而定。每次色谱进样量在广2毫升。所述步骤②中采用高效液相色谱作为分离植物留醇混合物的主要装置，所述的色谱柱，包括所有半制备型或制备型C18和C8高效液相色谱柱，柱尺寸大于等于9. 4X250 mmD所述步骤②中液相色谱流动相为乙腈和异丙醇的混合试剂，二者的体积比为 60 95 40^5 ；或为乙腈、异丙醇和水的混合试剂，三者之间的体积比为60 80 :38 15 :2 5。所述步骤②中液相色谱流速为0. 5 2 min/mL，紫外检测波长设为206 210 nm，每个循环的保留时间为2(Γ45分钟。所述步骤③在5(T60°C水浴中减压旋转蒸发去除各馏分中的有机溶剂；对旋蒸后有未除净的水，用氯仿及乙酸乙酯萃取除水后减压蒸发有机溶剂得最终产品。所述的最终产品可以室温下以氮气或氦气吹干。本专利技术的有益效果是该方法可在一次分离过程中同时获得多种留醇单体，多次进样可实现各单体从毫克级到克数级的分离制备，且纯度较高。由于该色谱条件为等梯度洗脱，因此可连续进样，节省分离时间，回收效率高。本专利技术的高效液相色谱方法对于包括植物留醇在内的天然产物纯品的提取方面具有重要的理论及实际意义，将在植物的分析化学、精细化工中发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。 具体实施例方式下述实施例中所用高效液相色谱仪为Agilent 1200型，配备四元泵、手动进样阀、紫外检测器、色谱工作站等。半制备型液相色谱柱均为Agilent公司的C18和C8柱。结晶用有机溶剂丙酮为分析纯。流动相的组成中，乙腈为色谱级，分析级异丙醇经过滤蒸馏后备用，水为二次蒸馏水。采用的原料是市场上可购买的从玉米或大豆的脱臭馏出物中提取的植物留醇混合物，为淡黄色片状或粉末状物质。实施例1:①用天平称量10克淡黄色植物留醇混合物，倒入250毫升锥形瓶中，加入50毫升丙酮，将该锥形瓶置于60°C水浴中，搅拌至固体完全溶解。将该锥形瓶从温水浴中拿出，静置于平台上，室温冷却，有白色针状晶体缓慢析出。该结晶过程持续12小时，有白色针状晶体缓慢析出。减压条件下，用50毫升布氏漏斗抽滤，滤液为淡黄色的溶液，为初始混合物中可溶于丙酮的杂质，可舍去。白色针状结晶物滤饼，为初步纯化的植物留醇混合物。②称取20毫克初步纯化后的植物留醇混合物，置于干净样品瓶中，加入10毫升乙腈，水浴加温40°C，使样品完全溶解于乙腈中，制成备用的饱和样品溶液。用2毫升色谱进样针吸取1毫升上述溶液，手动进样入高效液相色谱体系；色谱柱Agilent C18柱 (9.4X250 mm, 5 μ m)，流动相乙腈/异丙醇/水=60382，流速1. 5 mL/min，紫外检测波长206 nm，保留时间45分钟，对基线分离的各化合物的单峰，分别回收入各馏分瓶。完成一次分离过程后，立即再用进样针抽取1毫升上述样品溶液，重复上述操作步骤及分离过程，经10次循环进样一分离一回收，每次进样的相同出峰化合物可回本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种从混合植物甾醇中分离制备甾醇单体的方法，其特征在于包括以下步骤：①　将植物甾醇混合物完全溶解于丙酮中，室温冷却至结晶析出，抽滤并干燥；②　将步骤①所的产物溶解于乙腈中，进样入高效液相色谱柱，以乙腈／异丙醇／水作为流动相，对混合甾醇中的各化合物实现基线分离，对各单峰分别进行回收；多次循环进样，分别回收相同馏分的各单峰物质于相应回收瓶中；③　旋转蒸发去除各馏分中的溶剂，得最终产品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张欣，高俊兰，岳秋林，程备久，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34