一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法技术

一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法，它包括如下步骤：(1)取伪狂犬疫苗种毒；(2)抽提病毒基因组DNA；(3)将抽提的DNA产物转染细胞，培养，冻融收获毒液，即得无支原体的伪狂犬疫苗种毒。本发明专利技术提供的方法解决了人们一直渴望解决但始终未能取得成功的技术难题，彻底清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体，同时保持伪狂犬疫苗种毒的活性，容易制得效果好、安全性高的伪狂犬疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物制品领域。
技术介绍
伪狂犬病毒G^seudorabies virus, PRV)属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，是一种单股双链DNA病毒，有囊膜，可引起多种家畜和野生动物出现以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要病症的急性传染病-伪狂犬病。猪是伪狂犬病毒原发感染宿主，感染后可引起仔猪大批发病、死亡，引起母猪繁殖功能障碍-流产或产木乃伊胎、死胎、弱胎。伪狂犬病在世界范围内分布广泛，对猪业健康发展的危害程度仅次于口蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征。疫苗接种是有效防制伪狂犬疫病的重要手段，故伪狂犬疫苗接种也是我国各型猪场基本免疫程序的重要一环，我国巨大的生猪存栏量决定了伪狂犬疫苗市场容量之巨，现我国市面上已有数十家疫苗生产企业生产的伪狂犬疫苗，但是由于支原体对疫苗的污染，导致生产成本较高，且疫苗的安全性难以控制。支原体(Mycoplasma)又称霉形体，是介于细菌及病毒之间的一种原核生物，无细胞壁和固定形态，大小介于0. 2-0. 3 μ m之间，大部分可通过普通0. 22 μ m细菌滤器。支原体污染会干扰细胞正常新陈代谢，影响DNA和RNA的合成，从而引起病毒产量下降，影响产品品质；同时支原体注入动物机体内会造成动物免疫抑制甚至发病，我国颁布的《中华人民共和国兽药典》明文规定疫苗制品内不能含有支原体。伪狂犬疫苗生产的核心是伪狂犬种毒的制备，其在复苏、增殖及建立种子库的过程中面临受支原体污染的风险较大，而种毒是疫苗生产最初始的上游源头，一旦种毒发生支原体污染，将造成极其严重的后果。因此，除去疫苗种毒中的支原体是至关重要的，也是伪狂犬疫苗生产企业及科研人员极力解决的关键问题之一。除了通过合理清洁消毒、严格按规范操作降低支原体污染发生风险之外，目前已经报道的清除种毒支原体污染常见方法有很多种，如，过滤法、抗生素处理法、高温处理法、 接种动物法和接种动物法。但是，现有的方法均不能在保证伪狂犬病毒存活的情况下，彻底除掉支原体1.过滤法已有孔径小于0. 22 μ m的滤器可以滤去大多数病毒中的支原体，但是由于伪狂犬病毒粒子大小为0. 18 μ m左右，其与支原体大小很接近，目前通过过滤无法将二者有效分开；2.抗生素处理法支原体对某些抑制蛋白合成的抗生素敏感，如氯霉素、 庆大霉素、喹诺酮类及环丙沙星类，据报道这些药物能良好抑制或杀灭支原体，同时不影响病毒活性，但是这些抗生素对细胞有潜在毒性，同时其以抑制为主要的作用机理让人对其彻底杀灭支原体的效果担忧，该方法存在杀灭不彻底，停药后可能反复的风险，即使彻底杀灭整个用药周期至少需要14-21天的时间，另外，抗生素使用带来的耐药性问题是其另外一个难以预料的副作用；3.高温处理法加温至40-50°C维持一段时间，利用高温破坏支原体活性进而杀灭支原体，但是同处于一个体系中的病毒粒子的活性也会受到影响甚至失活，4.接种动物法此法是将受支原体污染的病毒液接种于实验动物如小鼠皮下或腹腔， 利用动物的免疫系统杀灭支原体，但是此法对动物卫生等级要求甚高，否则会有引入外源微生物的风险，至少需要SPF级，因而操作复杂、成本高、饲养管理难度大，很难保证杀灭彻底，周期较长。另一方面，伪狂犬疫苗种毒对猪是安全的，对小鼠或兔却具有致病性，即实验动物机体在彻底清除支原体前就会因伪狂犬发病死亡，难以达到去除支原体的目的；5.溶剂抽提法印彤等，“采用溶剂抽提法可完全去除病毒制品中的支原体”，1996年第19卷第 1期报道了利用乙醚和氯仿对污染支原体的5型腺病毒和RNA α病毒进行抽提可在保持病毒效价的前提下，完全除去其中支原体，但是伪狂犬病毒对乙醚和氯仿高度敏感，极易失活，专利技术人曾多次根据该文献报道的方法除去伪狂犬种毒中的支原体，结果发现该方法杀死支原体后，伪狂犬种毒本身也失活即病毒经此处理后死亡，无法重新增殖出病毒，不能再用于制备伪狂犬疫苗，不具有实际应用的价值。综上，人们一直以来寻找许多方法来去除伪狂犬病毒中的支原体，但是都未能达到理想的效果，要么难以彻底除去支原体，要么在彻底除去支原体的同时也会杀灭伪狂犬病毒。为了保证伪狂犬疫苗的品质，亟需寻找一种彻底除掉支原体，且能保证伪狂犬病毒活性的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的去除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法。本专利技术提供了，它包括如下步骤(1)取伪狂犬疫苗种毒；(2)抽提病毒基因组DNA ；(3)将抽提的DNA产物转染细胞，培养，冻融收获毒液，即得无支原体的伪狂犬疫苗种毒。其中，所述步骤(1)中狂犬疫苗种毒的滴度PFU彡IX IO6个/ml。其中，所述步骤(3)中抽提的DNA产物先与载体混合，再转染细胞。其中，所述的载体为阳离子脂质体或者磷酸钙。其中，所述步骤⑶中抽提的DNA产物与阳离子脂质体的质量体积比为 5-6 μ g 5-20 μ 1。其中，所述步骤(3)抽提的DNA产物与阳离子脂质体的质量体积比为 5-6 μ g 10 μ 1。其中，所述步骤(3)的中细胞的密度为65% -85%。其中，所述密度为70%-75%。还提供了上述方法制备的伪狂犬疫苗种毒。最后还提供了前述的伪狂犬疫苗种毒在制备伪狂犬疫苗中的用途。本专利技术提供的方法可以彻底除去伪狂犬疫苗种毒中的支原体，且能保持伪狂犬种毒活性，还不引入外源微生物污染，解决了人们一直渴望解决但始终未能取得成功的技术难题。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1培养法检测结果(非禽源支原体)。其中，A 猪鼻支原体作为阳性对照；B 人工模拟的被猪鼻支原体污染的病毒液；C 采用本专利技术方法清除支原体重新获得的病毒液； D 阴性对照(未污染支原体的病毒液)。图2培养法检测结果(禽源支原体)。其中，1 鸡滑液支原体作为阳性对照；2 人工模拟的被鸡滑液支原体污染的病毒液；3 采用本专利技术方法清除支原体重新获得的病毒液；4 阴性对照(未污染支原体的病毒液)。图3PCR法检测结果。其中，M =DNA分子量标准；1 非禽源支原体_猪鼻支原体阳性对照；2 人工模拟的被猪鼻支原体污染的病毒液；3 禽源支原体-鸡滑液支原体阳性对照；4 人工模拟的被鸡滑液支原体污染的病毒液；5 采用本专利技术方法清除支原体重新获得的病毒液(非禽源)；6 采用该法清除支原体重新获得的病毒液(禽源)；7 阴性对照(未污染支原体的病毒液)。图4本专利技术方法制备的伪狂犬种毒转染细胞的生长状态图。a 转染后第1天；b 转染后第3天；c 转染后第4天；d 转染后第5天；e 转染后第6天。图5培养法检测结果。其中，I 非禽源支原体-猪鼻支原体阳性对照；II 禽源支原体-鸡滑液支原体阳性对照；III 经本专利技术方法处理过的受支原体污染种毒；IV 阴性对照(未受支原体污染的病毒液)。图6PCR法检测结果。其中，M =DNA分子量标准；1 非禽源支原体_猪鼻支原体阳性对照；2 禽源支原体-鸡滑液支原体阳性对照；3 经本专利技术方法处理过的受本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：（１）取伪狂犬疫苗种毒；（２）抽提病毒基因组ＤＮＡ；（３）将抽提的ＤＮＡ产物转染细胞，培养，冻融收获毒液，即得无支原体的伪狂犬疫苗种毒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，
申请(专利权)人：四川华神兽用生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：90