本发明专利技术提供了一种用于检测柯萨奇病毒A16型(CA16)的快速检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被柯萨奇病毒A16型(CA16)特异性抗原VP1的单克隆抗体或多克隆抗体和质控抗鼠IgG，结合胶体金标记的柯萨奇病毒A16型(CA16)特异性抗原VP1的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中柯萨奇病毒A16型(CA16)。应用本发明专利技术试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合早期诊断，对柯萨奇病毒A16型(CA16)的感染诊断起到辅助作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原检测试纸条及其应用。
技术介绍
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种人类疾病严重的致病病原，其感染可以导致许多疾病，从较轻的呼吸道感染疾病，到比较严重的心肌炎、心包炎及神经系统的一些疾病，甚至可以引起婴幼儿死亡。CoxV可分A、B两组A组病毒有M个血清型，B组有6个血清型。B组所有型别和A组第9型有共同组特异性抗原；B组各型病毒血清型之间有交叉反应，而A组没有。感染人体的CoxV以A组居多，引起手足口病的CoxV多以A16型、A4型、 A5型、A7型、AlO型、B2型、B5型、B13型为主。CoxV为单股正链RNA病毒，分子量为、2 2. 8) X 106，呈球形，直径20-30nm，无包膜，含有由32个壳微粒形成的二十面体立体对称的衣壳；耐低温，对乙醚、乙醇、来苏尔等消毒液敏感，对热、干燥、紫外线等也较敏感。柯萨奇病毒是单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对称，无包膜。基因组全长为7389 7402个核苷酸，不包括3’端的多聚腺苷酸尾。在柯萨奇病毒基因组的5’端，以共价键结合了一个小的蛋白质，称为毒粒蛋白，叉称VPg ；而在3’末端有一个多聚腺苷酸尾，其由几十个到近百个腺苷酸连结而成。柯萨奇病毒RNA基因组的顺序依次为5’端非编码区，Pl区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。病毒外壳由结构蛋白VP1、 VP2、VP3和VP4构成，其中VP1、VP2、VP3裸露于病毒外壳表面，VP4隐藏于病毒外壳内面。CA16的基因组长约7400bp，包括5'及3'端的非编码区和中间一个大的开放读码框(ORF)，依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11个基因组成，主要编码产生病毒结构蛋白和病毒复制所需要的酶类。其中VPl区长891bp，编码含297个氨基酸的 VPl蛋白。VPl是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位，是肠道病毒血清型的分型依据。 VPl区的核苷酸序列也是肠道病毒基因分型的依据。利用VPl蛋白的单克隆抗体，可以通过双抗体夹心法检测CA16。目前，手足口病的诊断，除了依据临床症状外，实验室诊断是不可缺如的环节。实验室的诊断标准如下1)血液检查的细胞总数一般正常或偏高，分类时淋巴细胞较高，中性粒细胞较低。 2)有中枢神经系统并发症时，脑脊液细胞数可增多，蛋白升高。幻发病后从粪便、咽喉漱口液分离或检测到相关病毒。4)从脑脊液或疱疹液分离或检测到相关病毒。幻从早期血清中检测出相关病毒IgM抗体。6)恢复期血清中和抗体比急性期有>4倍的增长。然而到目前为止，还没有一种能够方便、快捷检测柯萨奇病毒A16型的检测方案的报道。
技术实现思路
(一 )、要解决的技术问题专利技术的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测柯萨奇病毒A16型(CA16)的试纸条，检测人类中柯萨奇病毒A16型(CA16)特异性抗原，用于柯萨奇病毒A16型(CA16)的辅助诊断。(二)、技术方案本专利技术提供了一种检测试纸条，它包含以下成分(1)包被柯萨奇病毒A16型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体和二抗 IgG两个条带的反应膜；(2)含有胶体金标记柯萨奇病毒A16型(CA16)特异性抗原VPl的单克隆抗体的结合物释放垫。上述二抗可以是抗鼠IgG 二抗，所述反应膜可以是硝酸纤维素膜，所述结合物释放垫可以是玻璃纤维膜。本专利技术检测试纸条可以按如下方法制备1)制备柯萨奇病毒A16型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体；2)将步骤1)制备的柯萨奇病毒A16型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；3)用胶体金标记抗柯萨奇病毒A16型特异性抗原VPl的单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。本专利技术还公开了所述试纸条在检测柯萨奇病毒A16型(CA16)中的应用。本专利技术通过采用纯化的柯萨奇病毒A16型(CA16)特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的柯萨奇病毒 A16型(CA16)特异性抗原VPl的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测标本中的柯萨奇病毒A16型(CA16)。(三)、有益效果本专利技术的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性检测样本中可能存在的柯萨奇病毒A16型(CA16)，达到快速筛检病人，及时控制疫情的目的。节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单， 易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合早期诊断，对柯萨奇病毒A16 型(CA16)的感染诊断起到辅助作用。附图说明图1 :A本专利技术试纸条的正面示意图；B本专利技术试纸条的侧面示意图。其中，1 吸水垫；2 硝酸纤维膜(T 柯萨奇病毒A16型(CA16)特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体的条带；C 包被抗鼠IgG的质控条带)；3 含有胶体金标记柯萨奇病毒A16型(CA16)特异性抗原VPl的单克隆抗体的聚酯膜；4 样品垫；5 反应支持物。图2 检测结果示意图。其中，从左至右依次为T、C两条线阳性；C 一条线阴性； Τ、C两条线阴性或仅有T线阳性，无效。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 抗柯萨奇病毒A16型VPl蛋白单克隆抗体的制备(1)免疫小鼠制备的基因工程抗原从-20低温冰箱取出溶解后，给BALB/C小鼠背部皮下注射 (O.aiig/只)，间隔10天。融合前3日，在小鼠腹腔以抗原0. Img进行攻击。免疫效果用 ELISA法进行检测。(2)骨髓瘤细胞SP2/0骨髓瘤细胞购于军事医学科学院微生物流行病研究所。用时将存储在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在含有10%小牛血清DMEM培养基中培养48-72小时，待细胞生长良好，细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈对数分裂，准备融合。(3)细胞融合制备好的SP2/0细胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴细胞分别配制成2 X 107/ml和 IXlOVml0各取Iml室温下混合。用0. 8ml，50%的PEG (分子量1500)作为融合剂；培养液用10%小牛血清DMEM。(4)阳性孔的检测和筛选ELISA法检测。包被CA71全病毒抗原酶标板。对融合细胞的培养上清液进行检测，选择ELISA效价OD值大于1.0的阳性孔进行亚克隆。共检出阳性克隆四株，选择13 株进行亚克隆操作。(5)单抗细胞株的亚克隆用有限稀释法对阳性克隆细胞株进行克隆化筛选。对筛选的的阳性克隆经过冻存、复苏、传代等过程，最终获得5株可稳定分泌特异性抗体的单克隆抗体细胞株。细胞株号为2A5，2E8，3B9，3D9，3G10。(6)单克隆抗体细胞株检定细胞株核型分析对上述杂交瘤细胞染色体进行检测为96条；证明他们是SP2/0 骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测试纸条，其特征在于，它包含：（１）包被柯萨奇病毒Ａ１６型特异性抗原ＶＰ１的单克隆抗体或多克隆抗体和二抗ＩｇＧ两个条带的反应膜；（２）含有胶体金标记柯萨奇病毒Ａ１６型特异性抗原ＶＰ１的单克隆抗体的结合物释放垫。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘明，
申请(专利权)人：北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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