本发明专利技术公开一种在肿瘤细胞中高效高特异表达靶基因的载体。该载体是一个环状载体，其序列如SEQ?ID?NO.1所示。T-VISA载体能在肿瘤细胞中高效高特异表达靶基因，表达效果与CMV启动子相当，但具有在正常组织细胞中极低表达的特点。因此本发明专利技术的T-VISA载体具有广泛的应用价值：1、利用T-VISA载体可以驱动任意靶基因在肿瘤细胞中高效高特异性表达，包括报告基因如Luciferase(荧光素酶)，GFP(绿色荧光蛋白)和治疗基因如p53(细胞凋亡蛋白基因)和IL-2(免疫调控蛋白基因)等。2、T-VISA载体可以与相应靶基因结合后进行肿瘤生物学，肿瘤信号传导、肿瘤基因调控和基因治疗的研究和应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种在肿瘤细胞中高效高特异表达靶基因的载体 T-VISA。
技术介绍
在肿瘤细胞中，高效高特异表达靶基因是研究肿瘤生物学、肿瘤信号传导、肿瘤基因调控和基因治疗的重要方法。目前采用的肿瘤特异性启动子表达靶基因，其活性低，效率差，难以对肿瘤生物学、信号传导和基因调控进行深入研究，特别是造成肿瘤的基因治疗无法在临床中应用。基因治疗已有20余年的发展历史，人们寄望它能成为手术切除放化疗等之外的有效的替代疗法。目前肿瘤基因治疗大多采用的巨细胞病毒启动子(CMV)是目前活性最高的启动子，但该启动子没有特异性，在正常细胞中也高表达目的基因，所开发的临床试验产品虽然有一定的疗效，但毒副作用大，无法得到SFDA (中国食品与药品管理局)和美国FDA(食品与药品管理局)的批准而用于临床。有人使用肿瘤特异启动子，大大减少了毒副作用，但由于活性低，其疗效也变得非常有限。因此，开发一种在肿瘤细胞中高特异性高效表达靶基因或治疗基因的载体是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在肿瘤细胞中高效高特异表达靶基因的载体T-VISA。本专利技术的在肿瘤细胞中高效高特异表达靶基因的载体T-VISA是一个环状载体， 其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术将报告基因荧光素酶Luciferase基因插入T-VISA载体中构成T-VlSA-Luc 质粒，对载体T-VISA的活性及特异性进行评价。将T-VlSA-Luc质粒转染卵巢癌细胞系和正常细胞系，结果显示Luciferase基因在卵巢癌细胞系中表达，但在正常卵巢细胞系中表达非常低。结果表明T-VISA载体能在卵巢癌细胞中高效高特异性表达靶基因。将T-VISA-Luc质粒转染乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞、乳腺癌干细胞系和正常细胞系，结果显示在十个乳腺癌细胞系和三个乳腺癌干细胞系具有很高活性，但在正常细胞系中表达非常低。在乳腺癌细胞系、乳腺癌干细胞系和正常细胞系中，T-VISA的活性分别是CMV的1. 8 (1. 7-4. 3)，2. 6 (2. 0-3. 2)和0. 006倍。结果表明T-VISA载体在乳腺癌细胞， 三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞系中能高效高特异性表达靶基因。进一步的检测T-VISA载体在小鼠体内肿瘤细胞中的活性和特异性。Balb/c裸鼠中原位接种卵巢细胞系Hey8，2周后，通过尾静脉注射50 μ g包含T-VISA-Luc质粒的脂质体，运用活体成像仪动态观察靶基因Luciferase。结果显示CMV-Luc导致Luciferase在小鼠肺组织、肿瘤组织和全身正常组织中表达，但T-VISA-Luc在小鼠肿瘤组织中高表达，在全身正常组织中表达很低。结果表明T-VISA-Luc在小鼠体内卵巢癌细胞中高效高特异性表达革巴基因Luciferase。综上所述，本专利技术的T-VISA载体能在肿瘤细胞中高效高特异表达靶基因，表达效果与CMV启动子相当，但其还具有在正常组织细胞中极低表达的优点。因此本专利技术的T-VISA载体具有广泛的应用价值1、可以利用T-VISA载体驱动任意靶基因在肿瘤细胞中高效高特异性表达，包括报告基因如Luciferase (荧光素酶)， GFP (绿色荧光蛋白)和治疗基因如p53 (细胞凋亡蛋白基因)，IL-2 (免疫调控蛋白基因) 等。2、T-VISA载体可以与相应靶基因结合后进行肿瘤生物学，肿瘤信号传导、肿瘤基因调控和基因治疗的研究和应用。附图说明 图1是质粒图谱，其中图IA是插入报告基因Luciferase的T-VlSA-Luc质粒图谱，图IB是CMV-Luc质粒结构示意图，其中CMV是指巨细胞病毒启动子，是目前活性最强无特异性启动子，图IC是T-VISA-Luc质粒结构示意图，是由hTERT(人端粒酶启动子)与 VISA(整合放大系统)构成的Iuciferase表达质粒；图2是T-VlSA-Luc在卵巢癌细胞中高效高特异表达靶基因Luciferase的效果图；图3是T-VISA-Luc在乳腺癌细胞，三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞系中高效高特异表达靶基因Luciferase的效果图；图4是T-VISA-Luc在小鼠体内卵巢癌细胞中高效高特性表达靶基因Luciferase 的图。具体实施例方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1 一、T-VISA 载体克隆端粒酶启动子hTERT，长度为418bp，其序列如SEQ ID NO. 2所示，具有肿瘤细胞特异性，但其活性在肿瘤细胞中不到CMV启动子活性的1%，因此无法广泛应用。将该启动子插入TSTA基本质粒启动子序列部分，形成T-TSTA，再将WPRE插入T-TSTA中靶基因的 3，-UTR,能增强 mRNA 的稳定性作用，由此构建 hTERT-VP16-GAL4_WPRE (VP16-GAL4-WPRE Integrated Systemic Amplifier，VISA，整合性系统放大器)调控系统，简称为T-VISA (整合性系统放大器)载体，其序列如SEQ ID NO. 1所示。在T-VISA载体中，hTERT启动子控制Gal4_VP2 (两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；Gal4-VP2融合蛋白与Gal4效应元件G5E4T结合，启动靶基因或目的基因的大量转录。该T-VISA载体主要包括hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)、WPRE (其序列如SEQ ID NO. 3所示)、G5E4T (其序列如SEQ ID NO. 4所示)和Gal4_VP2基因(其序列如SEQ ID N0. 5所示)。本实施例的T-VISA载体可以通过酶切下述T-VISA-Luc质粒，利用酶Nhel/Bglll 将荧光素酶Luciferase基因切除得到。二、T-VISA-Luc 质粒的构建pGL3. T-VISA-Luc (即T-VISA-Luc质粒)质粒的克隆构建步骤(一)pCRII-TOPO-hTERT 质粒克隆 1、常规方法提取乳腺癌MCF-7细胞(从美国ATCC公司购买)的DNA。2、以该DNA作为模板，设计扩增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(Forward)禾口下游(Reverse)弓丨物Forward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc_3' (XbaI)Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc age gc_3' ο3、以乳腺癌 MCF-7 细胞 DNA 为模板，hTERT PCR 引物(Forward -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc_3' ；Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gcagca gga cgc age gc_3' )、Pfu DNA polymerase、dNTP 禾口 PCR 反应液， 扩增获得hTERT启动子(_416to+l)产物，其序列如SEQ ID N0. 2所示。其PCR反应体系 10本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种在肿瘤细胞中高效高特异表达靶基因的载体Ｔ－ＶＩＳＡ，其特征在于，所述的载体为环状载体，其碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢小明，郭姣丽，谢新华，李来胜，孔亚楠，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：81
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