本发明专利技术公开了一种结合肺癌细胞的复合Fe3O4磁性纳米颗粒及其制备方法。其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的Fe3O4磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。本发明专利技术还公开了一种富集和检测痰液中肺癌细胞的方法，包括：a)采集痰液，充分液化痰液；b)加入所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；c)将反应液离心富集其中的细胞。将所得细胞重新悬浮，采用液基薄层细胞学检测系统(TCT)将该悬浮液制片、染色、封片、镜检。该方法检测痰液中肺癌细胞的阳性率比常规方法提高30％以上，检测效率明显提高，检测成本有所下降。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于高分子化学和细胞生物医学领域，特别涉及一种结合肺癌细胞的复合 Fe3O4磁性纳米颗粒及其制备方法，以及一种富集和检测痰液中肺癌细胞的方法。
技术介绍
肺癌居十大恶性肿瘤之首，具有“三高”现象发病率高、死亡率高、上升幅度高； 是影响人类健康的主要疾病，与爱滋病并列成为21世纪主要医学问题之一。凭借目前诊断肺癌的手段，一旦发现和确诊是肺癌，基本上处于中晚期，尚难以获得有效的控制。因此，实现肺癌的早期诊断是实现早期治疗的长期未能破解的国际医学难题。痰液细胞病理学检查是目前极有希望开发推广为早期诊断肺癌的最有效的方法。 目前存在的最主要问题是1、痰液送检费时费力；2、假阴性率高QO 40% )，原因在于 痰液制片手工操作而导致细胞丢失(标本不能全部取用)、涂片的质量太差(不均勻、过厚， 过多的黏液、血液或炎细胞遮盖了不正常的细胞、细胞形态保存不佳)，细胞成分复杂(大量脱落上皮细胞、炎症细胞)，脱落肺癌细胞散在，分布不均。所以，必须去除无关细胞，才能做到低成本地连续检测，大幅度提高阳性率。因此， 肺癌细胞分离富集是实现肺癌早期诊断这个国际性难题首先要解决的问题。如果能够寻找到一种比较简便实用的方法将肺癌细胞从痰液中分离出来富集，早期治疗肺癌就有希望。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对痰液中细胞成分复杂，检测痰液中肺癌脱落细胞假阴性率高的缺陷，提供一种结合肺癌细胞的复合狗304磁性纳米颗粒及其制备方法，和一种检测痰液中肺癌细胞的方法。该方法检测痰液中肺癌细胞具有较高的阳性率。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种结合肺癌细胞的复合 !^e3O4磁性纳米颗粒，其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的狗304磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA(葡萄球菌A蛋白)和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。所述的抗⑶44抗体优选兔抗人⑶44，抗CK7抗体优选兔抗人CK7。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种如上所述的结合肺癌细胞的复合狗304磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤1)制备!^e3O4磁性纳米颗粒；2)在步骤1)所得的!^e3O4磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺；3)在步骤2、所得的聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4磁性纳米颗粒表面标记对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白，该复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。本专利技术中，步骤1)制备!^e3O4磁性纳米颗粒的方法可以本领域常规方法，较佳的采用共沉淀法。更佳的步骤1)具体包括将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩尔质量10倍于铁离子的环氧氯丙烷形成溶胶，静置后形成凝胶；制得的凝胶经陈化后用去离子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝胶进行400°C下退火处理即制得!^e3O4 沉淀；将制得的!^e3O4沉淀依次用去离子水和乙醇交替清洗，至pH值为中性，真空干燥，即得!^e3O4磁性纳米颗粒。步骤1)所述的!^e3O4磁性纳米颗粒的平均粒径范围较佳的是15 50nm，更佳的是20nm。本专利技术中，步骤幻在!^e3O4磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺的方法可以采用现有技术，较佳的，步骤2、具体包括将!^e3O4磁性纳米颗粒置于PBS缓冲溶液中，超声分散， 缓慢加入聚乙酰亚胺(PEI)，慢速充分搅拌均勻后，移至恒温水浴上继续慢速搅拌M小时， 水浴温度保持30°C ；用磁分离法将固体从溶液中分离，将固体依次用蒸馏水和甲醇交替清洗至PH值为中性，真空干燥，即得PEI修饰的!^e3O4纳米粒子。本专利技术中，较佳的，步骤幻具体包括将聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4纳米粒子悬浮于 0. OlM pH7. 2TBS之中，得纳米粒子溶液，其中聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4纳米粒子的浓度约为 3 X IO13个/ml ；用0. OlM pH7. 2TBS分别溶解蛋白A和蛋白B,混勻，4°C反应30分钟，即得复合蛋白溶液，其中，蛋白A浓度为10mg/ml，蛋白B浓度为lmg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白 B是抗CD44抗体和/或抗CK7抗体，优选兔抗人CD44和/或兔抗人CK7 ；将上述复合蛋白溶液与上述纳米粒子溶液均勻混合，室温60分钟，即得复合纳米磁性颗粒溶液。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之三是一种富集痰液中肺癌细胞的方法，包括以下步骤a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步骤a)所得的液化痰液中加入所述的复合纳米磁性颗粒溶液进行反应；c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之四是一种检测痰液中肺癌细胞的方法，包括以下步骤a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步骤a)所得的液化痰液中加入所述的复合纳米磁性颗粒溶液进行反应；c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞，将所得细胞重新悬浮，然后采用液基薄层细胞学检测系统将该悬浮液制片、染色、封片、镜检。本专利技术中，步骤a)中采集和液化痰液的方法是本领域常规方法。较佳的，痰液中加入碱性裂解液以充分液化痰液，所述的碱性裂解液优选丨^蛋白酶！^，川^ NaOH的水溶液。本专利技术中，步骤b)所述的反应优选室温静置15分钟。本专利技术中，步骤c)离心富集细胞的方法是常规方法，所述的离心优选500rpm，5分钟；离心所得的细胞优选悬浮在保存液中，保存液优选10%甲醇水溶液。本专利技术中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。本专利技术所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本专利技术中所述的“室温”是指试验操作间的温度，一般为25V。相比于现有技术，本专利技术的有益效果如下本专利技术采用聚乙酰亚胺(PEI)对高磁性能狗304纳米颗粒表面进行氨基化处理，使聚乙酰亚胺上的亚甲基与铁配位，并通过调节 PH值和温度，使聚乙酰亚胺牢固与!^e3O4纳米颗粒相连接。该材料可以很好的分散于水溶液中，并且具有良好的生物相容性和顺磁性。为了提高结合肺癌细胞的能力，又标记了能结合肺癌细胞的复合蛋白，不仅有效地降低了成本，而且明显地提高了富集肺癌细胞的效率。 该复合I^e3O4纳米颗粒具有富集、分离痰液体系中肺癌细胞的功能，集成液基细胞病理学方法，提高了痰液中肺癌细胞检测的可靠性和准确性。检测痰液中肺癌细胞的阳性率比常规方法提高了 30%以上。并且增加了检测样本量，减少了被测者的往返，检测效率明显提高， 而且费用有所降低，适合于体检、普查。附图说明以下结合附图说明本专利技术的特征和有益效果。图1是聚乙烯亚胺包覆的纳米四氧化三铁纳米粒子。图2是复合纳米颗粒附着于肺癌脱落细胞表面。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 Fii3O4纳米颗粒的制备1)将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种结合肺癌细胞的复合Ｆｅ３Ｏ４磁性纳米颗粒，其特征在于，其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的Ｆｅ３Ｏ４磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白ＳＰＡ和选自抗ＣＤ４４抗体和抗ＣＫ７抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈岗，严彪，李成魁，李辉，
申请(专利权)人：同济大学附属上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：31
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