本发明专利技术公开了番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，其特征在于，制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂是用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗GPV单克隆抗体，然后用GPV单克隆抗体制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120；本发明专利技术还公开了番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立的乳胶凝集试验(LPA)和乳胶凝集抑制试验(LPAI)在鹅细小病毒抗原鉴定和番鸭小鹅瘟病诊断中的应用与在血清学调查和免疫抗体监测中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。
技术介绍
番鸭小鹅瘟病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起一月龄以内雏番鸭的病毒性传染病，该病1997年以来在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流行，目前全国各番鸭饲养区均有发生。临床上发病雏番鸭以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征，发病率50％～70％、病死率40％～65％，给养鸭业造成一定的经济损失。临床上该病不仅常与番鸭细小病毒病(三周病)混合感染，且常被基层兽医误诊为番鸭细小病毒病。由于抗小鹅瘟高免血清对该病具有较好的治疗效果，因此快速诊断是有效控制该病减少损失的前提。然而，我国至今尚缺乏商品化的番鸭小鹅瘟病快速诊断试剂，给临床诊断带来很大困难。因此，快速确诊该病的试剂不仅具有较好的应用价值和产业化前景，而且对有效控制该病是必不可少的。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂及其制备方法，它是通过如下技术方案来实现的：取一种来源于人工筛选的抗番鸭源鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)杂交瘤细胞株D11株(即：抗GPV杂交瘤细胞株D11株)，应用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(即：抗GPV单克隆抗体)，然后用抗GPV单克隆抗体标记聚苯乙烯乳胶制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC(即：中国典型培养物保藏中心)，保藏<br>日2011年4月15日，保藏编号：C201120。本专利技术的目的还要提供番鸭小鹅病乳胶凝集试剂的应用。与现有技术比较，应用本专利技术的试剂建立的乳胶凝集试验(latex particle agglutination，LPA)可用于临床诊断番鸭小鹅瘟病和鹅细小病毒(GPV)抗原鉴定；同时，根据该凝集试验能被小鹅瘟抗体特异抑制的原理，建立的乳胶凝集抑制试验(latex particle agglutination inhibition，LPAI)还可用于小鹅瘟病的血清学调查和疫苗免疫抗体监测。该试剂具有快速(检测抗原30分钟内出结果，检测抗体60分钟内出结果)、简便(不需仪器、肉眼可判定)、特异性强(不与其它病原发生交叉反应)、敏感性好、重复性和准确率高(与病毒分离的符合率89.3％)、保存期长(4℃～8℃保存一年)等优点。因此，本专利技术的番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，既可检测病原，也可检测抗体。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术进一步说明(但不是对本专利技术的限制)。并通过定性或定量的实验数据证明本专利技术的技术方案可以实现所述的用途和/或达到预期效果。番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的制备方法如下：将10％聚苯乙烯乳胶用0.1M pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释至1％，6000r/min离心5min，弃上清液，沉淀物用0.1M pH8.2GBS重悬到原体积，加等体积抗GPV单克隆抗体(蛋白浓度0.5～1mg/ml)，充分混匀，置37℃水浴箱中感作40min(每10min摇动数秒钟)后，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的0.1M pH8.2GBS洗2次，每次以6000r/min离心5min，沉淀重悬于0.1％BSA-GBS使乳胶终浓度为1％，并加入叠氮钠至终浓度为0.025％，即成番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。其中：1.抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体的制备：从液氮中取出抗GPV杂交瘤细胞株D11株，放入预先准备的37℃温水中，使其尽快融化后，1000r/min离心2min，弃冻存液，以细胞营养液(HT-D7777-10％FCS)重悬细胞后，将细胞移至预先加好细胞营养液的培养瓶中，37℃ CO2 6.0温箱中培养，经扩大培养到足够数量时，收集细胞离心，调细胞浓度达5×106个细胞/ml。腹腔接种12周龄BALB/c小鼠，5×105个细胞/0.1ml/只，约10天左右小鼠腹部明显臌起，以手触摸时皮肤有紧张感，即可用16～18号消毒针头采集腹水。将腹水10 000r/min离心15min，弃沉淀，收集上清即为抗GPV单克隆抗体，经Commassi brilliant blue(考马斯亮蓝R-250)法测定抗体蛋白浓度，分装，-20℃以下保存备用。2.乳胶凝集试剂制备2.1抗体稀释：以0.1M pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)将抗GPV单克隆抗体(腹水)稀释成含蛋白浓度1.0～0.5mg/ml，备用。2.2乳胶的预处理：将10％聚苯乙烯乳胶用0.1M pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释成为1％，6000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用0.1M pH8.2GBS重悬到原体积，备用。2.3乳胶凝集试剂制备：将上述预处理的聚苯乙烯乳胶2mL加等体积含蛋白浓度1.0～0.5mg/mL的抗GPV单克隆抗体，充分混匀，37℃水浴中感作40min(每10min摇动数秒钟)后，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的0.1M pH8.2GBS洗2次，每次以6000r/min离心5min，沉淀重悬于2mL的0.1％BSA-GBS中，并加入叠氮钠至终浓度为0.025％，即成番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。 3乳胶凝集试验(LPA)方法的建立：3.1样品采集与处理取濒死病鸭肝、脾、肾、胰等组织，用稀释液研磨成1∶1匀浆，加等体积氯仿振荡3～5min，以6000r/min离心15min，取水相为待检样品。3.2乳胶凝集试验(LPA)操作方法：用稀释液(pH7.2PBS或生理盐水)将待检样品作连续倍比稀释后，各取10ul不同稀释度的待检样品与等量致敏乳胶在洁净的玻片或96孔细胞培养板板盖上混匀，室温(22±4℃)或37℃水浴温箱中静置5～15min，肉眼观察凝集反应。试验设致敏乳胶对照、抗原对照和抗原加稀释液对照。以能出现“+”凝集的抗原最高稀释度的倒数为该抗原的凝集价。4乳胶凝集抑制试验(LPAI)方法的建立：4.1样品的采集与处理：常规采血并分离血清。4.2抗原凝集工作液制备：4.2.1抗原凝集价测定：按3.2测定抗原凝集效价。4.2.2抗原凝集价工作液配制及检验：如果抗原价测定结果为2-6(举例)，4个凝集单位＝2-6/2-2(2-4)，即将抗原1∶16稀释则为4个凝集单位(4U)。4.2.2.1配制：稀释液15ml，加病毒抗原1ml，使最终浓度为1∶16(即4U)，将1∶16稀释的抗原加等量稀释液即成2U的病毒抗原。4.2.2.2抗原凝集价滴定：检查4U的凝集价是否准确，应将本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，其特征在于，制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂是应用抗ＧＰＶ杂交瘤细胞株Ｄ１１株制备抗ＧＰＶ单克隆抗体，然后用抗ＧＰＶ单克隆抗体制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗ＧＰＶ杂交瘤细胞株Ｄ１１株，保藏在ＣＣＴＣＣ，保藏日２０１１年４月１５日，保藏编号：Ｃ２０１１２０。
【技术特征摘要】
1.番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，其特征在于，制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试
剂是应用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗GPV单克隆抗体，然后用抗GPV
单克隆抗体制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11
株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120。
2.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈少莺，朱小丽，林锋强，程晓霞，陈仕龙，王劭，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，陈少莺，
类型：发明
国别省市：35
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