细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒技术

本发明专利技术提供用简便操作可快速准确地判断混入被检试料中的细菌的细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒。本发明专利技术的细菌检测器具是微阵列型器具，其中根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面。根据从被检试料中制备的探针和固定在上述基板表面的寡核苷酸是否发生杂交，可简便、快速且准确地检测、鉴定被检试料中的细菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒，具体涉及细菌的特异性寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具、使用该细菌检测器具的极其准确且操作性高的细菌检测方法及细菌检测试剂盒。
技术介绍
例如麦芽酒精饮料中混入有害微生物时，会产生浑浊、风味劣化等现象，从而成为质量劣化的原因。更加具体地说，如对于啤酒来说，乳酸杆菌属(LactcAacilIus)、片球菌属(Pediococcus)、梳状菌属(Pectinatus)等是代表性的有害细菌。其中，短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)是有名的啤酒污染菌。作为检测这些有害细菌的方法，现在最普通的方法是，用膜过滤器将对象啤酒过滤后， 在适当的培养基中培养，然后检测生长的菌落。作为判断该菌落是否为上述有害细菌的方法，使用的方法是将从菌落中提取的 DNA作为模板，使用上述有害细菌特异性引物进行PCR反应，通过电泳来判断是否能够得到 PCR产物(如参照日本国特开平7489295号公报(公开日平成7年11月7日))。但是， 因为在该方法中每个菌种都需要使用多数引物进行多次PCR反应，操作极其烦杂，在快速性方面存在问题。此外，为了缩短时间，虽然可将多数引物混合并在1个试管内进行扩增反应，但可使用的引物数量有限，所以难于根据微量检体进行准确判断。为了解决上述问题点，使用了下述方法，即、设计含有各种菌种内普遍存在的基因的种特异性序列的部分可扩增的引物，扩增后用识别种特异性序列的限制酶切割扩增产物，以电泳得到的电泳带的大小来特定其为何种菌种的基因。但是，能够识别所有对象菌种的限制酶未必都存在，并且，需要用多种类限制酶分别切割得到的扩增产物提供给电泳这样极其烦杂的操作，在快速性、简便性方面存在问题。进而，为了解决上述问题，还实施了下述方法，S卩、用种特异性序列作探针，通过杂交来判断被检体中的DNA或RNA中是否存在与该序列互补的序列。但是，上述通过杂交进行判断的方法，对于非常近缘的DNA同源性高的菌种，也存在频繁发生与别的菌种进行错误杂交的交叉杂交问题，有时难于准确鉴定菌种。特别是，在上述代表性的啤酒污染菌即属于乳酸杆菌属的种中近缘菌非常多，使用频繁发生交叉杂交的方法，不能达到检测、鉴定有害细菌的目的。鉴于上述问题，本专利技术的目的是提供可以准确判断特定细菌是否存在的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具、使用该细菌检测器具通过简便操作能够进行快速准确判断的细菌检测方法及细菌检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术者为了解决上述课题进行了精心研究，其结果在麦芽酒精饮料的代表性污染细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中，发现了特定属或特定种特异性序列；并且发现使用根据该碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的器具，通过和来源于被检试料的核酸进行杂交，可快速且准确地检测、鉴定目的细菌，完成了本专利技术。本专利技术的细菌检测器具，是用于检测、鉴定被检试料中的细菌的器具，其特征在于，对象细菌是从(1)属于短乳杆菌(LactcAacillus brevis)的细菌、(2)属于酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的细菌、(3)属于片球菌属(Pediococcus)的细菌、(4)属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌、(5)属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌中选择的至少2种或2种以上的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌。本专利技术的(1) (5)的细菌，例如短乳杆菌(LactcAacillus brevis)是序列号 7 9及序列号71所示的碱基序列全部包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。酸面团乳杆菌(LactcAacillus lindneri)是序列号22 M所示的碱基序列全部包含在16S核糖体 RNA基因中的细菌。属于片球菌属(Pediococcus)的细菌是序列号36 45所示的碱基序列中至少2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。属于巨球形菌属(Megasphaera) 的细菌是序列号50 55所示的碱基序列中至少2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌是序列号56 58所示的碱基序列中至少 2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。作为本专利技术的细菌检测器具的检测对象细菌，优选包括(6)属于乳酸杆菌属 (Lactobacillus)的细菌、(7)属于链球菌属(Streptococcus)的细菌、(8)属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌、(9)属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌、(10)属于棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的细菌、(11)属于弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的细菌、(12)属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的细菌、属于发酵乳杆菌(LactcAacillusfermentum)的细菌、(14)属于坏发酵乳杆菌 (Lactobacillus malefermentans)的细菌、(15)属于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) Ii^ (Lactobacillus casei> Lactobacillus paracasein Lactobacillus zeae) ^tJ M "S、 (16)属于鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)的细菌、(17)属于布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri)的细菌、(18)属于而 久肠球菌(Enterococcus durans)的细菌、(19)属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的细菌。作为固定在基板表面的寡核苷酸，优选为下述所示的寡核苷酸，本专利技术的细菌检测器具的特征是，至少1个或1个以上的所述寡核苷酸固定在基板表面。(A)其是根据属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号2所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸。(B)其是根据短乳杆菌(LactcAacillus brevis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号8所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号9所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号71所示的碱基序列的寡核苷酸。(C)其是根据棒状乳杆菌(LactcAacillus coryniformis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号10所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号11所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号12所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．细菌检测器具，用于检测、鉴定被检试料中的细菌，其特征在于，对象细菌是从下述（１）～（５）中所述的细菌中选择的至少２种或２种以上的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌，（１）属于短乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）的细菌（２）属于酸面团乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｎｄｎｅｒｉ）的细菌（３）属于片球菌属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）的细菌（４）属于巨球形菌属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）的细菌（５）属于梳状菌属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）的细菌。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：儿玉由纪子，畑中一成，田中幸一，中川浩子，守屋彰悟，小佐野薰，
申请(专利权)人：三得利控股株式会社，
类型：发明
国别省市：JP