本发明专利技术提供一种固定化磷脂酶A1的方法，在交联酶聚集体技术基础上进行改进，先将游离磷脂酶A1制成交联酶聚集体，再将得到交联酶聚集体进行包埋，得到固定化磷脂酶A1。研究了酶液浓度、沉淀剂饱和度、沉淀pH、沉淀时间、交联剂浓度、交联时间、海藻酸钠浓度和钙离子浓度等不同固定化条件对磷脂酶固定化效率和催化效果的影响，并对固定化酶膜的酶学性质进行了讨论。通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用包埋-交联聚集体的方法固定化磷脂酶的优势。根据本包埋-交联酶聚集体化学稳定性和机械性能优异等特性固定化磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和保持较高的酶活回收率，最终得到的固定化酶活回收率为80.2％，重复使用7次相对酶活力保留在65％以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种固定化磷脂酶的方法。
技术介绍
磷脂酶A1在磷脂改性、油脂精炼等方面有广泛应用，但游离磷脂酶A1价格昂贵，且不易回收，催化水解时条件苛刻；与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、 工艺简便等优点。交联酶聚集体(CLEAs)，是一类新型的固定化酶技术，具有制备简单、酶活回收率高、操作和保存稳定性强等优点，被广泛运用于固定化酶的制备中。近年来，CLEAs技术与材料学、印迹工程、介质工程、反应工程学等相结合取得了一系列新进展，包括载体固定化 CLEAs、包埋CLEAs、印迹法CLEAs、多酶CLEAs、CLEAs膜浆反应器等，在手性分子拆分与合成、抗生素生产等领域取得了一些成果。有些酶的CLEAs相对游离酶的酶活回收率竟超过 100%，某些脂酶的交联酶聚集体活性甚至可提高10倍以上。但是由于其不易回收等缺点， 使酶的重复利用率降低，因此为得到活力高且回收率高的固定化酶。
技术实现思路
本专利技术是针对固定化磷脂酶A1活性低等问题，而提出的用包埋-交联酶聚集体来进行磷脂酶A1固定化的方法。用包埋-交联酶聚集体固定化磷脂酶A1的方法通过以下步骤实现一、磷脂酶A1的固定化。二、酶活力的测定。三、固定化条件的优化。四、固定化酶酶学性质的讨论。五、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释包埋-交联磷脂酶A1聚集体的优势。利用包埋-交联酶聚集体来进行磷脂酶A1的固定化中，包埋-交联酶聚集体具有化学稳定性好、机械性能优异等优点，根据这些优点来固定磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和保持较高的酶活回收率，最终得到的固定化酶活回收率为80. 2%，重复使用7次相对酶活力保留在65% 以上。具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步描述本专利技术，但这些实施例仅是例证性的，并不对本专利技术的保护范围构成任何影响，本领域技术人员应该理解的是，根据本专利技术的精神所做的任何修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。具体实施方式一用包埋-交联酶聚集体来固定磷脂酶A1的方法通过以下步骤实现一、磷脂酶A1的固定化1、磷脂酶A1聚集体的制备将ImL酶加入到一定量的pH值为 5. 0的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中，在0°C下缓慢加入无水乙醇并持续搅拌，从而保证酶聚集体颗粒均勻。冰浴反应一段时间，然后于IOOOOrpm离心，收集沉淀。2、交联磷脂酶A1聚集体的制备及包埋过程向聚集体悬浮液中加入一定浓度的戊二醛，搅拌反应一段时间， 离心去除上清液，用缓冲液冲洗交联酶聚集体数次，直到洗液中检测不到任何的活力，收集沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮。在一定浓度的20mL海藻酸钠溶液中加入上述酶聚集体lmL，搅拌均勻。静止一段时间后，用灭菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以约5滴/s注入一定浓度CaCl2溶液中制成微胶囊，将形成的微胶囊在4°C的CaCl2溶液中放置一段时间使其进一步硬化。然后抽滤得到硬化的微胶囊，用无菌生理盐水洗涤3 5次，以洗去表面的 CaCl2，然后进行冷冻干燥备用。二、酶活力的测定一定量的底物无油磷脂溶于预定pH值的缓冲液中，经磁力搅拌器充分搅拌，混合均勻。取4个IOOmL三角瓶，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95%乙醇15mL，于预定温度的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入一定质量的经复水后的固定化酶，立即混勻计时，在预定温度的水浴中180r/min的条件振荡准确反应15min，然后于样品瓶中立即补加95%乙醇15mL 终止反应，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH标准溶液滴定，计算标准碱液平均消耗量。 三、固定化条件的优化分别在酶液浓度0. 02 0. 07g/mL、沉淀剂饱和度65 90%、沉淀 pH3 8、沉淀时间15 65min、交联剂浓度0. 1 0. 6%、交联时间3. 5 8. 5h、海藻酸钠浓度0. 5 3%、钙离子浓度0. 1 0. 35mol/L的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。四、固定化酶酶学性质的讨论在温度40 70°C，PH 4. 5 7范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适PH值。并通过重复测定酶活来讨论固定化酶的使用稳定性。五、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释包埋-交联磷脂酶A1聚集体的优势。具体实施方式二 本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将酶液浓度0. 03 0. 07g/mL的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将沉淀剂饱和度70 85%的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将沉淀 PH4 7的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将沉淀时间25 55min的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将交联剂浓度0. 2 0. 5%的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将交联时间4. 5 7. 5h的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将海藻酸钠浓度1 2. 5%的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将将钙离子浓度0. 15 0. 3mol/L的条件下进行磷脂酶A1的固定。其它步骤与具体实施方式一相同。权利要求1.一种包埋-交联磷脂酶A1聚集体的方法，其特征在于用包埋-交联酶聚集体来固定磷脂酶的方法通过以下步骤实现一、磷脂酶A1的固定化1、磷脂酶A1聚集体的制备将 ImL酶加入到一定量的pH值为5.0的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中，在0°C下缓慢加入无水乙醇并持续搅拌，从而保证酶聚集体颗粒均勻。冰浴反应一段时间，然后于IOOOOrpm离心，收集沉淀。2、交联磷脂酶A1聚集体的制备及包埋过程向聚集体悬浮液中加入一定浓度的戊二醛，搅拌反应一段时间，离心去除上清液，用缓冲液冲洗交联酶聚集体数次，直到洗液中检测不到任何的活力，收集沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮。在一定浓度的20mL海藻酸钠溶液中加入上述酶聚集体lmL，搅拌均勻。静止一段时间后，用灭菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以约5滴/s注入一定浓度CaCl2溶液中制成微胶囊，将形成的微胶囊在4°C的 CaCl2溶液中放置一段时间使其进一步硬化。然后抽滤得到硬化的微胶囊，用无菌生理盐水洗涤3 5次，以洗去表面的CaCl2，然后进行冷冻干燥备用。二、酶活力的测定一定量的底物无油磷脂溶于预定PH值的缓冲液中，经磁力搅拌器充分搅拌，混合均勻。取4个IOOmL 三角瓶，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95%乙醇 15m本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种包埋－交联磷脂酶Ａ１聚集体的方法，其特征在于用包埋－交联酶聚集体来固定磷脂酶的方法通过以下步骤实现：一、磷脂酶Ａ１的固定化：１、磷脂酶Ａ１聚集体的制备：将１ｍＬ酶加入到一定量的ｐＨ值为５．０的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中，在０℃下缓慢加入无水乙醇并持续搅拌，从而保证酶聚集体颗粒均匀。冰浴反应一段时间，然后于１００００ｒｐｍ离心，收集沉淀。２、交联磷脂酶Ａ１聚集体的制备及包埋过程：向聚集体悬浮液中加入一定浓度的戊二醛，搅拌反应一段时间，离心去除上清液，用缓冲液冲洗交联酶聚集体数次，直到洗液中检测不到任何的活力，收集沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮。在一定浓度的２０ｍＬ海藻酸钠溶液中加入上述酶聚集体１ｍＬ，搅拌均匀。静止一段时间后，用灭菌后的５ｍＬ注射器吸入上述混合液，以约５滴／ｓ注入一定浓度ＣａＣｌ２溶液中制成微胶囊，将形成的微胶囊在４℃的ＣａＣｌ２溶液中放置一段时间使其进一步硬化。然后抽滤得到硬化的微胶囊，用无菌生理盐水洗涤３～５次，以洗去表面的ＣａＣｌ２，然后进行冷冻干燥备用。二、酶活力的测定：一定量的底物无油磷脂溶于预定ｐＨ值的缓冲液中，经磁力搅拌器充分搅拌，混合均匀。取４个１００ｍＬ三角瓶，２个作为空白瓶，２个作为样品瓶，各加底物溶液２５ｍＬ，再于空白瓶中加入９５％乙醇１５ｍＬ，于预定温度的水浴中预热５ｍｉｎ，然后在各瓶中加入一定质量的经复水后的固定化酶，立即混匀计时，在预定温度的水浴中１８０ｒ／ｍｉｎ的条件振荡准确反应１５ｍｉｎ，然后于样品瓶中立即补加９５％乙醇１５ｍＬ终止反应，取出，用微量滴定管和配置好的ＮａＯＨ标准溶液滴定，计算标准碱液平均消耗量。三、固定化条件的优化：分别在酶液浓度０．０２～０．０７ｇ／ｍＬ、沉淀剂饱和度６５～９０％、沉淀ｐＨ３～８、沉淀时间１５～６５ｍｉｎ、交联剂浓度０．１～０．６％、交联时间３．５～８．５ｈ、海藻酸钠浓度０．５～３％、钙离子浓度０．１～０．３５ｍｏｌ／Ｌ的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。四、固定化酶酶学性质的讨论：在温度４０～７０℃，ＰＨ ４．５～７范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适ｐＨ值。并通过重复测定酶活来讨论固定化酶的使用稳定性。五、通过固定化酶膜的ＳＥＭ图像进一步解释包埋－交联磷脂酶Ａ１聚集体的优势。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于殿宇，胡立志，王立琦，杜晶，王妍，李越，张佳宁，时敏，陈晓慧，李志平，王雪，宋云花，周旋，奚会松，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93
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