本发明专利技术公开了一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法，所述引物是由具有序列表中的SEQ?ID?NO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ?ID?NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸，与所述引物配合使用的探针具有序列表中的SEQ?ID?NO：3的核苷酸序列。用本发明专利技术的方法及试剂盒检测小鼠呼肠孤病毒III型具有快速简单、灵敏度高、特异性强且回收率高的优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法。
技术介绍
自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典O010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠呼肠孤病毒III型属于一类，人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物，对人体来说有很大的危险性。因此，鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。呼肠孤病毒(Reoviridae)全称为呼吸道(respiratory)、肠道(enteric)和孤儿 (orphan)病毒。呼肠孤病毒的基因组是分节段的双股RNA。1994年ICTV第6次病毒分类报告中，统一定位为属，将呼肠孤病毒科下设正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、科州蜱传热病毒属、水生呼肠孤病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属及水稻矮缩条叶枯病毒属。呼肠孤病毒分为I、II和III型，其中呼肠孤病毒III型(Reovirus 3,Reo3)属于呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属，Reo3具有特征的二十面体对称的双层衣壳结构，病毒粒子的核心由十条双链RNA基因组以及其密切链接的内衣壳组成，此外还有一层外衣壳，无囊膜，是呼肠孤病毒中致病性最强的。该病毒能感染所有哺乳动物，在啮齿类动物群体中多呈隐性感染。Reo3可引起小鼠“油毛综合征”，表现为黄疸、腹泻、矮小、毛皮油亮以及神经症状如运动失调等。还可引起乳鼠多种系统性疾病，包括坏死性肝炎、心肌炎及胰腺炎以及脑膜炎等病变，死亡率可达50 %。药典规定的鼠源病毒检测方法有细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。 这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction Real Time PCR)1 ,便,且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 5’ _3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。迄今为止，实时荧光定量PCR技术检测小鼠呼肠孤病毒 111型方面还未见有报道，无疑有着很广阔的发展空间。
技术实现思路
为了解决现有小鼠呼肠孤病毒III型检测方法的不足，本专利技术提供了一种实时荧光定量PCR检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。本专利技术的一个目的是提供一对用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物。本专利技术提供的引物，是由具有序列表中的SEQ ID NO 1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO :2的下游引物组成的一对寡核苷酸。序列表中的SEQ ID NO :1由20个碱基组成；序列表中的SEQ ID NO 2由19个碱基组成。本专利技术人设计了多对PCR引物，经过长期大量的实验从众多引物对中筛选出了由上述上游引物和下游引物组成的引物对。其扩增片断大小为lOObp。该引物对小鼠呼肠孤病毒III型具有高度的保守性，且与小鼠基因组不具有显著的同源性，使用该引物进行PCR 扩增，可实现准确定性、定量检测。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的探针，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO 3的核苷酸序列，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述探针中荧光报告基团可选自包括但不限于FAM、VIC、J0E、HEX中的任意一种， 优选为FAM ；所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse，优选为TAMRA。所述序列表中的SEQ ID NO 3由27个碱基组成。本专利技术的再一个目的是提供一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的方法，所述方法使用上述提及引物及探针进行实时荧光定量PCR检测。优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。优选地，所述实时荧光定量PCR的退火温度为60°C。优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件为48°C，15min ;95°C，IOmin ;95°C， 15sec，60°C，40sec，共 40 个循环。优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为扩增含序列表中SEQ ID NO 4 所示的碱基同源序列的PMD18-T载体，得到190bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的标准曲线。本专利技术的又一个目的是提供一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的试剂盒，所述试剂盒含上述提及的引物探针。优选地，所述试剂盒的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母 tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。优选地，所述RT-PCR扩增试剂为 2 X Taqman PCR Mix,40 X TaqmanRT-Enzyme MIX, 也可直接使用 Taqman RNA-Ct I-Step kit。优选地，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得扩增含序列表中SEQ ID NO :4所示的碱基同源序列的PMD18-T载体，得到190bp的DNA片段，体外转录本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用于检测小鼠呼肠孤病毒ＩＩＩ型的引物，其特征在于，所述引物是由具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的上游引物与具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２的下游引物组成的一对寡核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭淑萍，李萃，王刚，蒋立新，周志文，
申请(专利权)人：舒泰神北京生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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