本发明专利技术提供了用于有效加工和定位转基因植物中的麦草畏单加氧酶(DMO)的某些叶绿体转运肽的鉴定和用途。本发明专利技术也提供了产生耐受麦草畏的植物的方法、控制杂草生长的方法和产生食物、饲料和其它产品的方法，以及当出土前或出土后施用麦草畏时提供麦草畏耐受性的种子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物生物
更具体的说，本专利技术涉及允许有效加工和定位植物中的麦草畏单加氧酶的叶绿体转运肽的鉴定和用途。相关技术描述DMO (麦草畏单加氧酶)在植物中催化除草剂麦草畏(3，6-二氯-邻茴香酸)降解为无毒的3，6_ 二氯水杨酸(3，6-DCSA)，从而赋予除草剂耐受性。DMO的活性需要用于将电子从NADH向麦草畏转移的两种中间蛋白质还原酶和铁氧还蛋白(美国专利7，022，896 ； Herman等人，200 。然而，转基因植物中的麦草畏耐受性已通过单独用DMO转化得到证明， 表明植物内源性的还原酶和铁氧还蛋白可以在电子转移中代替。参与电子转移的植物铁氧还蛋白位于质体中。因此，为了获得DMO的高效性能并因此获得提高的麦草畏耐受性，需要将DMO靶向至叶绿体。在许多情况下，这种靶向可以通过被称作叶绿体转运肽(CTP)或者质体转运肽的 N-末端延伸的存在而实现。如果表达的多肽将要在植物质体(如叶绿体)中区室化，细菌来源的染色体转基因必须具有与编码表达的多肽的序列相融合的编码CTP序列的序列。因此，将外源多肽定位到叶绿体中通常是借助于将编码CTP序列的多核苷酸序列可操作地连接到编码外源多肽的多核苷酸的5’区域上来完成的。CTP在向质体内转移过程中通过加工步骤被去除。但是，加工效率可能受CTP的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影响。Weeks等人(美国专利7，022, 896)描述了玉米cab_m7信号序列(参见，Becker 等人，1992和PCT WO 97/41228 ；GenBank登记号X53398)和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列 (Creissen等人，1992和PCT WO 97/41228)在将DMO靶向至植物质体方面的潜在用途，但是没有给出关于加工或者靶向效率的数据。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶 (Rubisco)小亚基编码序列的27个氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(RbcS) CTP，也已经用于将DMO靶向至叶绿体(例如，美国临时申请60/811，152)。然而， 已经在蛋白质印迹(Western blot)分析过程中发现，这种豌豆RbcS CTP产生一个正确加工的DMO蛋白质条带( 38 kDa)，但是还产生一个与DMO和RbcS编码区的27个氨基酸相对应的较大的条带( 41kDa)。额外的氨基酸可能不利地影响DMO的活性。此外，由于 DMO的不完全加工，转基因产品中额外的蛋白质造成监管方面的障碍，为了使产品在政府机构注册的目的，还需要在产品表征方面投入额外的努力，由此增加了产品注册的费用。因此，需要鉴定有效地产生正确加工的DMO的CTP，从而提供完全的DMO活性以及易于表征产品的优点。专利技术概述本专利技术的一方面涉及一种重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列编码包括选自SEQ ID NOs :1-11的序列的叶绿体转运肽。在某些实施方案中，重组DNA分子包括选自SEQ ID NOs 12-22的核苷酸序列。在某些实施方案中，重组DNA分子包括编码选自SEQ IDNOs :24、沈、28、30、32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。包括与在植物细胞中具有功能的启动子可操作地连接的DNA分子的DNA构建体也是本专利技术的一方面。另一方面，本专利技术包括用DNA分子转化的植物细胞，所述DNA分子包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，其中，叶绿体转运肽序列选自SEQ ID NOs =I-Il0在某些实施方案中，重组DNA分子包括选自SEQ ID NOs 12-22的核苷酸序列。在某些实施方案中，DNA分子包括编码选自SEQ ID NOs =24,26, 观、30、32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列，其中，DNA分子可操作地连接到在植物细胞中具有功能的启动子上。在特定的实施方案中，DNA分子包括选自SEQ ID NOs 23、25、27、29、31、33、35、37 和 39 的核苷酸序列。在某些实施方案中，植物细胞是双子叶植物细胞。在其它实施方案中，植物细胞是单子叶植物细胞。在特定的实施方案中，植物细胞是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物细胞。 本专利技术也涉及包括这样的细胞的植物组织培养物，涉及包括这样的细胞的转基因种子和转基因植物。在某些实施方案中，转基因种子或者植物是双子叶种子或植物。在其它实施方案中，转基因种子或者植物是单子叶种子或者植物。转基因种子或者植物可以是大豆、棉花、 玉米或者油菜籽种子或者植物。本专利技术进一步涉及产生耐受麦草畏的植物的方法，包括将重组DNA分子引入植物细胞中，并由其再生植物，所述DNA分子包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，其中，编码叶绿体转运肽的序列选自SEQ ID NOs :12-22。在某些实施方案中，重组DNA分子包含编码选自SEQ ID NOs :24,26,28,30, 32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。DNA分子可以可操作地连接到在植物细胞中具有功能的启动子上。该方法可以进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生耐受麦草畏的植物，其中亲本植株和/或第二植株包括所述DNA构建体，并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和/或第二植株遗传了该DNA构建体。一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法是本专利技术的进一步的方面，该方法包括将选择的CTP可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。另一方面，本专利技术涉及一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法，包括种植这样的植物或其种子，并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。 麦草畏除草剂可以自上方向农作物生长环境施用，由此麦草畏除草剂的量不损伤所述的植物或其种子，却损伤与该植物或其种子基因型相同但是缺乏构建体的植物或者种子。本专利技术的进一步的方面涉及生产食物、饲料或者工业产品的方法，包括a)获得植物，该植物包括按照5’到3’的方向可操作地连接到编码叶绿体转运肽的核苷酸序列和编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列或其部分上的编码在植物细胞中具有功能的启动子的核苷酸序列；b)从所述植物或其部分制备食物、饲料、纤维或者工业产品。在该方法的某些实施方案中，食物或者饲料是谷物、粗粉、油、淀粉、面粉或者蛋白4质。在该方法的其它的实施方案中，工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或者营养品 针对出土前(pre emergence)施用麦草畏提供保护的、包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA上的编码叶绿体转运肽的DNA的耐受麦草畏的种子，是本专利技术的进一步的方面。在某些实施方案中，耐受麦草畏的种子包括编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 例如选自SEQ ID NOs :12-22的核苷酸序列。耐受麦草畏的种子可以进一步包括编码选自 SEQ ID NOs :M、26J8、30、32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。本专利技术的另一方面涉及提高单子叶植物的直立能力(standability)的方法，包括a)获得并培育通过将亲本植株与它自本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组ＤＮＡ分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的ＤＮＡ序列上的编码叶绿体转运肽的ＤＮＡ序列，其中，编码叶绿体转运肽的ＤＮＡ序列编码ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６的多肽序列。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·C·C·冯，M·玛尔文，S·弗拉辛斯基，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：US
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