本发明专利技术公开了一种微生物体内合成脂肪醇的方法，该方法是将脂肪酰辅酶A还原酶基因克隆于相应表达载体上，再将构建好的质粒转化进入相应宿主菌，通过诱导表达脂酰辅酶A还原酶，从而改造异养微生物体内的脂肪酸代谢途径以生产脂肪醇。本发明专利技术实现了在微生物体内通过生物合成的方法合成脂肪醇，该技术是一种可再生的、低消耗的技术，且这种环保的生产方式能够减少对稀缺资源石油的消耗，也不需要再进行化学改造就可以直接生产脂肪醇，在工业上有很大的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于可再生能源和生物质能源以及化工原料生产领域，具体涉及改造异养微生物自身脂肪酸代谢途径从而生产脂肪醇的方法。
技术介绍
脂肪醇(fatty alcohol)是洗涤剂用表面活性剂的原料之一，在洗涤剂、护肤品、 化妆品、药品中有大量运用。脂肪醇最早是由鲸蜡制取的，所得的混合脂肪醇经磺化中和后成为硫酸盐，是最早的一种阴离子洗涤剂。其后开发利用来源比较丰富的椰子油、棕榈油和牛油为原料，水解所得脂肪酸再还原为醇，统称为天然脂肪醇。石油化学工业发展后，以石油产品为原料，生产的脂肪醇称为合成脂肪醇。但是依靠石油产品为原料的脂肪醇也得依靠石油的储备量，在资源日益稀缺的今天，这种发展方式将会逐渐淘汰，因此，需要一种更加环保，可再生的生产方式。如果能够通过在改造后的脂肪酸代谢通路中异源表达脂肪醇合成酶，即脂肪酰辅酶A还原酶，即可以通过微生物发酵产生大量的脂肪醇。Michael 等人在 2000年纯化了 jojoba 的 fatty acyl CoA reductase,并证明该基因——jojoba far能将脂肪酸还原成为脂肪醇，该工作发表在“Plant Physiology"( James G. Metz, Michael R. Pollard 1 , Lana Anderson, Thomas R. Hayes, and Michael W. Lassner. 2000.Purification of a Jojoba Embryo Fatty Acyl-Coenzyme A Reductase and Expression of Its cDNA in High Erucic Acid Rapeseed. Vol. 122: 635 - 644)。 Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的蓝细菌Syn-LY2菌株中分别表达了来自于jojoba，鼠，拟南芥等的脂肪酰辅酶A还原酶FAR，发现异源表达jojoba及其中一种拟南芥FAR的蓝细菌能够合成脂肪醇，而异源表达其他的几种FAR的蓝细菌不能产生脂肪醇。该工作发表在“Metabolic Engineering，，上(Tan X , Yao L, Lu X. et al. 2010. Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons in cyanobacteria. Metabolic Engineering 13 (2011) 169 - 176)。刘天罡教授等人开发了一个“cell free”体系，将脂肪酸代谢途径中的限速步骤进行了研究，指导如何提高微生物体内的脂肪酸含量，该工作发表于"Metabolic Engineering”(Tiangang Liu，Harmit Vora , Chaitan Khosia. 2010. Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli. Metabolic Engineering 12 :378 - 386)。月旨酰辅酶 A 还原酶基因便于进行优化，目前可以进行遗传操纵的微生物种类繁多，脂肪酸合成代谢途径又是每种微生物生存的必需条件，并且目前的研究已经对该条途径认识较为深刻，其限速步骤基本清楚，利于进行改造。目前仅有学者在能够进行光合自养的蓝细菌中利用了 jojoba far基因生产脂肪醇，众所周知，由于异养微生物生长迅速并且需要外源补充营养物质，这就便于通过补充培养基或者增加某些营养成分来提高其生产能力，使其在工业上实现大规模产业化生产。并且由于其必须依赖人工补给养料，所以可以严格控制其生产的各个阶段， 防止其肆意生长而造成无法控制的局面。目前工业上已经有许多利用异养微生物生产发酵获得产品的成功实例，利用脂酰辅酶A还原酶基因在异养微生物体内通过改造其自身代谢途径生产脂肪醇有很大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用异养微生物进行生物合成脂肪醇的方法，在异养微生物体内改造其脂肪酸代谢途径以及表达外源蛋白以生产重要的化工原料——脂肪醇。为实现上述目的，本专利技术提供的在异养微生物体内合成脂肪醇的方法，其是将脂肪酰辅酶A还原酶基因导入异养微生物体内，并将该基因克隆于表达载体上，导入相应的异养微生物体内，并诱导表达。所述脂肪酰辅酶A还原酶基因优选为jojoba /ar基因，其编码SEQ ID No. 2所示的蛋白质。或者编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有jojoba far蛋白同等活性的由jo jcAa far衍生得到的蛋白质。本专利技术所述异养微生物可以是真核异养微生物或原核异养微生物，包括细菌、真菌、放线菌等。此外，本专利技术方法还包括通过改造异养微生物代谢途径或者根据微生物密码子的偏爱性对脂酰辅酶A还原酶基因进行优化，以提高脂肪醇的产量。此外，本专利技术方法还包括对转化脂酰辅酶A还原酶基因异养微生物进行耐受性筛选，获得优势菌株，从而提高脂肪醇的产量。其中，所述改造的异养微生物代谢途径是该微生物体内的脂肪酸代谢途径，包括 提高脂肪酸产量或者降低脂肪酸产量用以生产脂肪醇的途径，例如在大肠杆菌中导入 PMSD8质粒，过量表达fatty acetyl-CoA carboxylase,提高用以生产脂肪醇的脂肪酸含量；改变该微生物体内脂肪酸代谢途径中间物用以生产脂肪醇的途径，例如敲除大肠杆菌中的fadE基因以积累更多脂肪酸代谢途径中间物的脂肪酰辅酶A，从而获得更多的脂肪醇；改变该微生物体内脂肪酸代谢途径衍生物用以生产脂肪醇的途径。本专利技术还提供一种异养微生物，其是转化脂肪酰辅酶A还原酶基因的异养微生物。此外，如上所述还包括对其代谢途径进行改造获得的脂肪醇提高的异养微生物。本专利技术的优点是在异养微生物中引入外源基因改造其自身的脂肪酸代谢途径以实现生产工业原料脂肪醇的目的，不需要通过过多的化学合成反应，减少了环境的污染，也减少了对石油储量的消耗。同时，由于大部分异养微生物生长速度快，便于进行遗传操作， 其抗污染性能优异，且人工可以调节其生长速度和防止其肆意生长破坏环境，种种因素表明改造异养微生物进行工业生产是切实可行的。附图说明图1为设计合成的jojoba Ar的基因构造图。图2为设计构建的PRL104表达载体示意图。图3为质粒pRL105的示意图，》如far基因通过其两端的I和炀ο I限制性内切酶位点克隆于PRL104载体上。图4为质粒pRL106的示意图，PCR扩增出得jbjbh far基因通过其两端的MfeI 和损ο I限制性内切酶位点并克隆于pED8载体上。图5为带有pRL104的酵母经半乳糖诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表示 pentadecanoL·图6为带有pRL105的酵母经半乳糖诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS 结果图。C12:0表不dodecanol ；C14:0表不tetradecanol ；C15:0表不pentadecanol ；C16:0 表不 hexadecanol ；C18 0 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种在异养微生物体内合成脂肪醇的方法，其是将脂肪酰辅酶Ａ还原酶基因导入异养微生物体内，并使该基因在该微生物体内表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，刘然，朱发银，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83
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