本发明专利技术公开Roundup?Ready转基因大豆检测用引物组及其检测试剂盒。本试剂盒由引物组、BstDNA聚合酶、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，该试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，具有高特异性。本发明专利技术的快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低，而且鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。采用了大豆内源性基因lectin作为内标，避免核酸提取造成的误差及假阴性的产生，实行了实时监测，大大节省检测时间，节约人力物力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测试剂，具体涉及一种Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其诊断试剂盒。
技术介绍
孟山都公司于1994年研制的抗草甘膦品种大豆，转化了来自于微生物 Agrobacterium tumefaciens的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4 EPSPS)编码基因，能够抵抗除草剂草甘膦对莽草酸合成途径的抑制，使转基因大豆在喷洒除草剂之后能够正常生长。该品种的受体是大豆品种A5403，转基因大豆基因组中整合了外源的CP4 EPSPS基因、E35S启动子和NOS终止子。该品种是目前种植面积最大的转基因大豆品种， 广泛应用在食用油和食品的加工生产当中。为了加强对转基因产品的监督和管理，目前发展了多种转基因成分检测方法，从基于蛋白质的ELISA检测技术到基于核酸的聚合酶链式反应(PCR)技术以及快速发展的基因芯片技术。其中PCR检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，这种技术通过检测转基因产品中含有的外源核酸片段来鉴定，随着荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)的出现，不仅能够进行转基因产品的定性鉴定，而且可以对转基因成分进行定量。以PCR技术为代表的转基因产品检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通PCR技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而Real time PCR技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。基因芯片技术能够实现快速和高通量的检测，然而价格昂贵，检测成本高。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足转基因产品检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是转基因产品检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplication of DNA,简称 LAMP)具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测转基因大豆快速诊断试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对可用于环介导等温扩增技术检测Roundup Ready转基因大豆EPSPS-N0S基因，且对该EPSPS-N0S基因具有高特异性的检测用引物组。本专利技术的另一个目的在于提供一种检测成本低、使用方便、检测速度快、特异性高的基于环介导等温扩增技术的转基因大豆快速诊断试剂盒。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案予以实现的一、本专利技术的Roundup Ready转基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的Roundup Ready转基因大豆EPSPS -NOS基因序列，选取Roundup Ready转基因大豆EPSPS-N0S基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别Roundup Ready转基因大豆EPSPS-N0S基因的特异性引物组，通过LAMP法来鉴定Roundup Ready转基因大豆 EPSPS-N0S基因，该EPSPS-N0S基因引物组由如下四条引物组成 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:13所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:15所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。 二、本专利技术的大豆内源性基因lectin基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的lectin基因序列，选取lectin基因的特异性序列，然后分析设计出的， 通过LAMP法来鉴定lectin基因，该内源性基因lectin引物组由如下四条引物组成 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:19所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:22所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:25所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。三、本专利技术的Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒，是由EPSPS-N0S基因引物、lectin基因引物、feiDNA聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中上述每 IL 反应液中含有 1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-HCl、10 12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol 硫酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、1 1. 25ml TritonX_100、0. 8 Imol 甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ；优选的比例是每 IL 反应液中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、 IOmmol 硫酸镁、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/ B3 各 0. 25moL·上述显色液优选为荧光染料STOR Green I或EvaGreen。 上述稳定液优选为石蜡油。上述阳性对照为EPSPS-N0S基因DNA片段。四、本专利技术基因快速诊断试剂盒的生产工艺1、分别将EPSPS-N0S基因和lectin基因内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后， 定量配制，浓度检测，抽样质检；2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、将稳定液无菌分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。五、本专利技术基因快速诊断试剂盒的检测方法 1、样品处理待测样品中DNA的提取和含量测定按国标按照GB/T 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ转基因大豆检测用的ＥＰＳＰＳ－ＮＯＳ基因引物组，其特征在于，由外引物Ｆ３、外引物Ｂ３、内引物ＦＩＰ和内引物ＢＩＰ组成，其中：外引物Ｆ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示；外引物Ｂ３的核苷酸序列如ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２所示；内引物ＦＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示；内引物ＢＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示；或者，外引物Ｆ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５所示；外引物Ｂ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６所示；内引物ＦＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７所示；内引物ＢＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８所示；或者，外引物Ｆ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９所示；外引物Ｂ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示；内引物ＦＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０所示；内引物ＢＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示；或者，外引物Ｆ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１所示；外引物Ｂ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２所示；内引物ＦＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１３所示；内引物ＢＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４所示；或者，外引物Ｆ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５所示；外引物Ｂ３的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６所示；内引物ＦＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７所示；内引物ＢＩＰ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８所示。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹以诚，杜正平，陈洵，李志勇，高东微，茅丽娜，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81
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