一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，步骤如下：(1)甜瓜无菌苗的生成；(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；(3)转化：对适宜大小的甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶，暴露或损伤顶端生长点(附图1)，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；(4)筛选：从生长点长出幼苗(附图2)，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；(5)使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株，进行子代鉴定。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。可以在一定程度上克服基因型的限制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于农业生物
和植物基因工程领域。
技术介绍
目前甜瓜的遗传转化方法主要有农杆菌介导的组织培养法，以及不需要组织培养的基因枪法、花粉管通道法和子房注射法等，简介如下基因枪法利用基因枪，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法，但是其转化效率相对较低。花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。 该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握，和基因枪法类似，其转化效率较低。子房注射法子房注射法是对整体植株的早期胚细胞转化DNA。直接将质粒DNA注射到植物的子房，此法更适用于子房较大的植物，如西瓜、黄瓜、西瓜等。采用这种方法，无需进行细胞或原生质体的组织培养，可以在田间或温室进行，比花粉管通道或农杆菌介导的遗传转化等方法导入外缘DNA更简单，但是假阳性率较高。在甜瓜再生体系中，农杆菌介导的组织培养法主要是利用根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有的Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染甜瓜伤口细胞后，可将T-DNA插入到甜瓜基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物转化体系，人们将目的基因插入到改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。但是由于甜瓜的再生体系建立起来相对比较困难，特别是由于甜瓜组培苗的玻璃化现象比较严重，造成了成苗及其困难的情况，大多数情况下，难以获得真正的转基因植株。这一关键技术的限制因素在于获得转化细胞之后，难以从转化的阳性细胞获得植株。所以说，尽管该方法理论基础相对清楚，技术方法最成熟，但是相对于一些组织培养再生能力较差的植物来说，该方法的应用却存在着一定的局限性。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术要解决的问题是提供一种改良的通过农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，以获得高频率的转基因植株，进行甜瓜的基因工程改良。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。可以在一定程度上克服基因型的限制。本专利技术是通过以下技术方案实现的，步骤如下(1)甜瓜无菌苗的生成；(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；(3)转化对适宜大小的甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶， 暴露或损伤顶端生长点，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；(4)筛选 从生长点长出幼苗，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；( 使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株，进行子代鉴定。所述步骤(1)具体如下甜瓜无菌苗的生成甜瓜种子去壳后，用70%乙醇(体积浓度)浸泡30 45s，用无菌水洗1 2次，而后用0. 1 %的HgCl2溶液(质量浓度)浸泡 8 lOmin，再用无菌水冲洗4 5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS 发芽培养基上，26士 1°C暗培养2 3天，待胚根长出后于3000Lx光照强度、1 / 光周期下培养5 7天，得甜瓜无菌苗。所述步骤( 具体如下含有目的基因农杆菌的活化与重悬用无菌牙签从平板上挑取含有目的基因的农杆菌单菌落接种至20ml附加抗生素的pH为7. O的LB液体培养基上，280C，180r/min培养至OD600 = 0 . 6 0. 8 ；取菌液加至相同培养基上，28°C，180r/min 继续培养5 6小时，培养至菌液浓度OD600 = O. 5 O. 6 ；5000r/min，4°C离心5min,收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4°C离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4°C离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体后，即可以用于转化，备用。所述附加的抗生素为50mg/L的利福平。所述菌液培养至0D_ = 0. 6 0. 8时，取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH 为7. O的LB液体培养基上。所述步骤(3)具体如下转化待步骤(1)得到的甜瓜无菌苗的子叶将要展开时， 从子叶的基部将子叶剪切掉，然后用牙签粘取少量经步骤( 活化了的农杆菌菌液轻轻地涂抹在切口处，沈士 1°C暗培养2 3天，再在3000LX光照强度、1 / 光周期下培养。所述步骤(4)具体如下蹄选当切口处长出的再生芽长到Icm以上时，剪切，移到筛选培养基上筛选培养，得幼苗。若底部叶片变黄可继续剪切顶端新芽继续选择培养，直至成苗。所述筛选培养基的配方为MS+含有选择标记抗性的抗生素+羧苄青霉素300mg/ L所述步骤( 具体如下生根及移栽将幼苗从选择培养基上转移至含有选择压的生根培养基上进行生根培养，待长出不定根后(约两周后)，打开瓶口，室内炼苗3天左右，然后从培养基中取出，洗净培养基后在水中浸泡至长出新根，而后移栽至大田。所述含有选择压的生根培养基的配方为l/2MS+0. 05mg/L 6-BA+lmg/L NAA+琼脂 7g/L, PH5. 8。本专利技术的农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，克服了基因型对甜瓜再生的限制，并可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。附图说明图1为甜瓜子叶被剪切后照片。图2涂抹农杆菌后甜瓜生长点再生情况。图3为PCR反应程序示意图。图4为荧光定量标准曲线。图5为转基因植株的PCR鉴定电泳图，泳道1、2为转化植株，泳道3为野生型植株 P为质粒对照。图6为转基因植株、野生植株和PreC008-CmMlo2质粒的扩增曲线和熔点曲线示意图，其中，A 转化植株1扩增曲线；B 转化植株1熔点曲线；C 转化植株2扩增曲线；D 转化植株2熔点曲线；E 野生型植株扩增曲线；F 野生型植株熔点曲线；G :PFGC1008-CmMlo2 质粒扩增曲线；H :PFGC1008-CmMlo2质粒熔点曲线。图7为转化植株和野生型植株的表观差异示意图，其中A =WT-I为甜瓜野生型， C5-6为获得的阳性转化植株。B 左，接种后的WT-1，感白粉病。右接种后的转化植株C5-6， 表现为抗白粉病。C:左，感病的WT-I后期生长情况。右，转化植株后期生长情况。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1利用农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法转化CmMlo2基因，获得抗白粉病甜瓜种质，步骤如下一、甜瓜CmMlo2基因的克隆l、cDNA第一链的合成Trizol 法提取叶片总 RNA。Smart RACE cDNA Amplification Kit 合成 cDNA。2、甜瓜CmMlo2基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于，步骤如下：（１）甜瓜无菌苗的生成；（２）含有目的基因农杆菌的活化与重悬；（３）转化：对甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶，暴露或损伤顶端生长点，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；（４）筛选：从生长点长出幼苗，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；（５）使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程鸿，孔维萍，
申请(专利权)人：甘肃省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：62