一种联苯双加氧酶在降解多氯联苯中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种联苯双加氧酶在降解多氯联苯中的应用。具体包括以下步骤：首先，构建偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因荧光假单胞菌表达基因载体；其次，对含有该偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶的表达基因载体荧光假单胞菌进行遗传转化；最后，对上述所得转化子降解二羟基联苯结果进行测定。本发明专利技术可用于制备降解多氯联苯微生物基因工程菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属微生物基因工程领域，具体涉及一种联苯双加氧酶在降解多氯联苯中的应用。
技术介绍
多氯联苯(Polychlorinated biphenyls)是一类持久性有机污染物 (Persistentorganic pollutants,简称POPs)，对自然生态系统和人类健康都有一定的危害作用。多氯联苯作为一类分布广，污染量较大的持久性有机污染物，对环境存在着很大的潜在危害。修复多氯联苯对环境的污染已经愈显重要，目前主要有非生物降解和生物降解两种方法。尽管目前多氯联苯降解的方法很多，但是大多数处于实验阶段，尤其是生物降解法，前景很大，但是还有很长的一段路要走。而非生物降解法虽然有不少缺点，但是实际操作和工业化生产中已有很大的应用，如果在此基础上进行合理的改革和创新，相信可以对多氯联苯和其它相关环境污染物的治理和修复起到很大的作用。我国对多氯联苯污染研究还较少，需要加强这方面技术的研究探索。生物降解法主要是指微生物修复法和植物修复法。1973年首次报道微生物具有降解多氯联苯的能力，且多氯联苯分子上氯原子数目影响微生物的降解效率Ahmed和 Focht, Can J Micro，1973，19 :47_52。后续研究证实苯环上氯原子的个数增加会阻碍多氯联苯的降解以及氯原子在苯环上的位置也会影响降解效率。微生物法还可以进一步分为无机化和共代谢两种。无机化即在好氧或厌氧条件下以多氯联苯为碳源或能源，降解多氯联苯满足自身的生长和繁殖的需要。共代谢是指微生物不以多氯联苯污染物为碳源，但是一样可以达到转化污染物的目的Borjia等，Process Biochem，2005，40 :1999_2013。 除了细菌，部分真菌也能降解低浓度的多氯联苯，但是降解效率相对较低Kamei等，Appl Microbiol Biotechnol,2006,73 :932-940。植物体修复多氯联苯主要有直接修复和体外修复两种，即直接吸收土壤中多氯联苯或者释放酶等物质在体外对多氯联苯进行降解。植物-微生物联合降解法是目前研究的一个热点，如紫花苜蓿-菌根真菌-根瘤菌联合法对多氯联苯污染土壤的修复效果较好，该法较单独某种降解法效率更高崔力拓等，农业环境科学学报，2008，27(1) :226-229h另外，植物转基因也为生物降解多氯联苯提供了新的方法Sylvestre 等，Curr Opin Biotechnol，2009，20 :242_247。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种联苯双加氧酶在降解多氯联苯中的应用，本专利技术方法可用于制备降解多氯联苯微生物基因工程菌。一种联苯双加氧酶降解多氯联苯的方法，具体包括以下步骤首先，构建偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因的荧光假单胞菌表达基因载体；其次，使含有该偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶的表达基因载体荧光假单胞菌遗传转化；最后，对所得转化子降解二羟基联苯的结果进行测定。所述方法可用于制备降解多氯联苯微生物基因工程菌。所述方法在降解多氯联苯中的应用。有益效果本专利技术通过构建偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因的荧光假单胞菌表达载体，并在荧光假单胞菌中成功表达并降解二羟基联苯。本专利技术表明构建荧光假单胞菌表达载体能够显著提高荧光假单胞菌的降解能力。附图说明图1为荧光假单胞菌表达载体酶切鉴定电泳图，其中A为Pfbl690载体，B为二羟基联苯双加氧酶基因。图2为转化子降解二羟基联苯的测定结果，其中B为二羟基联苯双加氧酶基因。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述，但不限制本专利技术。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a 和荧光假单胞菌(Pseudomonas putida)EGll 由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、连接酶、dNTP、10XPCRbuffer和 DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。表达载体所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。带有pGM 启动子和tlt2终止子的荧光假单胞菌表达载体PFB1690由上海市农业科学院生物技术研究所基因工程研究室构建。下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行Sambook J, FretsE F， Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press,1989。实施例1构建偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因的荧光假单胞菌表达基因载体(一 )试验方法上海市农业科学院生物技术研基因工程研究室构建的带有pGM启动子和tlt2终止子的荧光假单胞菌表达载体PFB1690的特点如下用pGM启动子和tlt2终止子控制目标基因的表达，Km抗性基因的作为筛选标记。从含偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因的克隆载体质粒经BamHI和 Sac I双酶切后，DNA回收试剂盒回收900bp左右的二羟基联苯双加氧酶基因片段。将此片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的荧光假单胞菌表达基因载体 PFB1690。( 二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳检测构建好的荧光假单胞菌表达载体，显示酶切条带正确，为3. Okb左右的载体和1. Okb的偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因(参见图1)。实施例2荧光假单胞菌表达基因载体的遗传转化(一 )试验方法1、感受态制备(1)在2YT平板划线培养，培养温度为。(2)挑取2YT固体培养基上的直径为2_3mm的新鲜农杆菌单菌落，在含ImL无菌 2YT培养液的灭菌^pendorf中通过Vortex振荡使菌落扩散。(3)在5mL的2YT培养液中，于，275rpm转速下培养过夜。(4)把5mL菌液稀释入500mL的2YT液体培养液中，于培养至OD55tl为0. 5 0. 7 5X108cells/mL)。(5)把菌液倒入预冷的离心管中，于4°C下2600g离心12 15分钟，小心倒去上清。(6)用等体积4°C下预冷的无菌水重新充分悬浮菌体，3500g离心10分钟，小心倒去上清。(7)再用0. 5倍体积4°C下预冷的无菌水重新充分悬浮菌体，3500g离心10分钟， 小心倒去上清。(8)重新充分悬浮菌体于1 2mL经4°C预冷的无菌的10%甘油中。(9)该菌液可立即使用或冻于-70°C存放，-70°C存放一周后转化效率下降10倍左右，以后的半年时间内较稳定。2、电击转化(1)在1. 5mL的印pendorf中，加入40 μ L菌液和1 2 μ L的质粒DNA (0. 4pg 0. 3 μ g)，在0. 2cm直径的电击杯中混勻，冰上放置1分钟左右。(2)调节电击参数为 25 μ F, 12. 5kV/cm, 400 Ω。(3)电击，放电时间为4 5msec。(4)电击转化后，即在菌体中加入1. OmL表达培养液。(5)在下培养1小时，涂于加入Km(50 μ g/mL)抗菌素的2YT平板。( 二)试验结果经过过夜培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种联苯双加氧酶降解多氯联苯的方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，构建偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因荧光假单胞菌表达基因载体；其次，对含有该偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶的表达基因载体荧光假单胞菌进行遗传转化；最后，对上述所得转化子降解二羟基联苯结果进行测定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊爱生，姚泉洪，彭日荷，帅建军，田永生，赵伟，付晓燕，金晓芬，朱波，许晶，韩红娟，陈晨，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：31