本发明专利技术公开一个可抑制羊痘病毒的siRNA序列，这个序列为GUGCUCCUAUUAUACUAAU。相关的实验提示本发明专利技术的这一序列可以抑制羊痘病毒P32基因的表达，可在制备抗羊痘病毒的疫苗中的应用，也可在制备抗羊痘病毒的药物中的应用，更进一步讲，本发明专利技术的序列可在培育具有抗羊痘病毒的羊品种中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一个序列，以及这个序列的用途。确切讲本专利涉及一种可抑制羊痘病毒的序列，以及这个序列的用途。
技术介绍
羊痘(Capripox，CP)包括绵羊痘、山羊痘和牛的皮肤疙瘩病，其中前两者是由绵羊痘病毒(She印pox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分别引起绵羊和山羊发生的接触性传染病。病畜体温升高，全身出现丘疹或结节、水疱、内脏病变甚至死亡， 给世界养羊业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为法定必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。羊痘的预防和控制一直是研究的热点。P32蛋白是羊痘病毒的囊膜蛋白，由319-3M个氨基酸组成，具有跨膜的螺旋结构，该结构位于C端287 307位氨基酸处。P32蛋白是从羊痘病毒感染细胞中分离得到的结构蛋白，分子量为32kDa。此蛋白为目前世界各地分离、鉴定的CPV的各毒株所共有特异很强且含有重要的抗原决定簇，它能够刺激豚鼠迅速产生抗CPV的中和抗体。P32蛋白是羊痘病毒基因组中研究背景相对最为清楚的蛋白，因此，如果干扰掉羊痘病毒的P32基因的表达，将会降低病毒的免疫原性，从而降低病毒的致病性。但目前世界上并没有基于RNA干扰技术靶向羊痘病毒的研究的报道，也没有RNA干扰方法在P32蛋白的研究的报道。因此 P32基因作为RNA干扰靶向的目的基因是一个较为理想的选择。
技术实现思路
本专利技术给出一个人工序列，实验中这一序列表现出对羊痘病毒P32基因具有抑制作用。本专利技术的序列为GUGCUCCUAUUAUACUAAU，在本专利技术中被命名为siRNA_P32。相关的实验表明，本专利技术的序列siRNA_P32可以抑制羊痘病毒P32基因的表达。相关的实验提示本专利技术的序列siRNA_P32可在制备抗羊痘病毒的疫苗中的应用， 也可在制备抗羊痘病毒的药物中的应用。更进一步，本专利技术的序列siRNA_P32可在培育具有抗羊痘病毒的羊品种中应用。 例如敲除相关的基因以培育对羊痘病毒具有自然抵抗能力的羊的新品种。附图说明图1为空载体pEGFP-Nl转染BHK21细胞对照荧光表达观察图，其中左图和右图分别为空载体表达后在荧光显微镜采用绿色荧光暗场和明场下的表达情况。图2为重组质粒PEGFP-P32转染BHK21细胞对照荧光表达观察，即P32基因真核表达载体构建以后在BHK21细胞中表达的鉴定，其中左图和右图分别为pEGFP-P32表达后在荧光显微镜采用绿色荧光暗场和明场下的表达情况，从图2可看出pEGFP-P32在BHK21 细胞中得到了表达。图3为PEGFP-P32和阴性对照siRNA共转染BHK21细胞荧光表达观察，其中左图和右图分别为PEGFP-P32和siRNA阴性对照共转染后在荧光显微镜采用绿色荧光暗场和明场下的表达情况。图4为未转染质粒的BHK21细胞阴性对照荧光表达观察，即空白对照图，其中左图和右图为什么也没有转染的BHK21细胞在荧光显微镜采用绿色荧光暗场和明场下的表达情况。图5为pEGFP-P32和siRNA_P32共转染的BHK21荧光表达观察，其中左图和右图分别为共转染PEGFP-P32和siRNA-P32的BHK21细胞在在荧光显微镜采用绿色荧光暗场和明场下的表达情况。由上述图中看出，跟对照相比，图5所示的共转染pEGFP-P32和siRNA_P32的组荧光明显少于对照组的图3，这说明siRNA-P32能够抑制P32的表达。图6为未转染的阴性细胞对照组的流式细胞仪检测结果。图7为只转染空载体pEGFP-Nl的细胞经流式细胞仪检测结果。图8为重组质粒pEGFP-P32和对照siRNA共转染BHK21细胞后经流式细胞仪检测， 结果转染了 siRNA对照后，pEGFP-P32表达阳性细胞率为60%。图9为重组质粒pEGFP-P32和siRNA_P32共转染BHK21细胞后经流式细胞仪检测，结果转染了 siRNA-P32后，pEGFP-P32表达阳性细胞率为4. 2%。与阴性对照组相比， PEGFP-P32 表达下降了 93%。图10为RT-PCR检测共转染pEGFP_P32与siRNA_P32的BHK21细胞的基因组。收集转染后4 的细胞，用Trizol法提取RNA，反转录后进行PCR扩增p32，在Tm为45°C 30s 条件下相同体系扩增BHK21的β -actin。其中1泳道为转染pEGFP_P32和对照siRNA的细胞RT-PCR ；2泳道为仅转染pEGFP-P32的细胞RT-PCR ；3泳道为仅转染空质粒pEGFP-Nl的细胞RT-PCR ；4泳道为共转染pEGFP-P32和siRNA_P32的细胞RT-PCR ；5泳道为以水为模板 RT-PCR空白对照。Labworks分析系统上进行图象处理及灰度分析结果表明，与阴性对照组相比，对照siRNA-P32对P32蛋白抑制率为78. 4%0具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术进行详细解说1.序列的制备本专利技术设计的序列为GUGCUCCUAUUAUACUAAU。将设计好的序列发送至上海吉玛生物工程有限公司进行5’端修饰合成。2. pEGFP-P32表达载体的构建使用TaKaRa公司DNA提取试剂盒从山羊痘病毒Vero细胞毒株中提取DNA，以提取纯化的病毒DNA为模板进行扩增，PCR扩增上游引物为5' -GTCCTCGAGATGGCAGATA-3‘，下游引物5' -GCGGATCCAACTATATACGT-3 ‘，参见见文献“.山羊痘病毒古浪株P32毒力蛋白的结构模拟与分析”赵志荀，吴国华，颜新敏，崔力凡，李健，朱海霞，张强.《中国兽医科学》，2010，40 (08) :771-777。PCR 反应体系为=IOXPCR Buffer (含 Mg2+) 5 μ L，dNTPs4 μ L， 模板lyL，引物F、P各lyL，rTaq酶0. 5yL，补超纯水至50yL。反应条件为95°C 5min ； 94°C 45s, 54°C 45s, 72°C 45s，30个循环；72°C IOmin0经反应获得的目的基因用胶回收试剂盒回收后，直接连入PM D18-T simple载体并转化Dffia大肠杆菌。经蓝白斑筛选挑选白斑，小量制备质粒，以Biol和BamHI酶切和PCR方法鉴定阳性克隆并送大连宝生物公司测序。用Biol、BamHI对阳性pMD18-T simple质粒进行双酶切，回收目的片段。用T4DNA 连接酶连接到经》iol、BamHI双酶切、纯化、回收的pEGFP-Nl大片段上并转化入Dffia大肠杆菌中，涂布于含有50μ L/mL卡那霉素的LB培养基平板，置于37°C培养箱过夜培养，经蓝白斑筛选挑选白斑，小量制备质粒，以》iol和BamHI酶切和测序方法鉴定所构建表达质粒 PEGFP-P32序列完全正确且读码框无错误。3. pEGFP-P32 和 siRNA_P32 共转染 BHK-21 细胞将鉴定好的pEGFP-P32菌落转入IOOml大瓶培养，进行中量质粒提取(按说明操作)，再次经酶切消化鉴定后测OD值，计算出浓度，备转染用。按常规方法，将BHK21细胞以每孔0. 5X IO5个接种于M孔板，待单层细胞生长至80% 90%后，每孔按优化好的质粒D本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一个靶向抑制羊痘病毒Ｐ３２基因的ｓｉＲＮＡ序列ｓｉＲＮＡ－Ｐ３２，其特征是ｓｉＲＮＡ－Ｐ３２的序列为：ＧＵＧＣＵＣＣＵＡＵＵＡＵＡＣＵＡＡＵ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张强，赵志荀，吴国华，颜新敏，李键，朱海霞，崔立凡，高顺平，才学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62
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