本发明专利技术属于生物检测领域，提供了一种将Cd-VIA族纳米颗粒应用于淀粉酶活性的检测方法。第一步，合成淀粉稳定的Cd-VIA族纳米颗粒；第二步，离心纳米颗粒，向沉积物中加入去离子水，超声波分散获得产品；第三步，将已知不同活性的淀粉酶样品、磷酸缓冲液和去离子水混合，向其中加入第二步产品后立即开始计时，记录混合液中出现浑浊时一一对应的时间。以酶活性倒数为横坐标、该时间为纵坐标作图，采用线性拟合获得校准关系式；第四步，对活性未知的淀粉酶样品按第三步操作，记录出现浑浊时所需时间。将此时间代入第三步校准关系式，计算出未知的酶活。上述淀粉酶样品包括标准酶试剂、唾液样品。该酶活检测方法简单实用，具有快速、成本低廉等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生化医药
，特别涉及酶活性的检测方法。
技术介绍
生命体体液内蛋白质的消化功能对于维持人类健康有着重要作用。淀粉酶是其中的一种重要蛋白质。它能够反映内源性肾上腺素活力，可作为交感神经系统的一种生物标志物。其活性的高低对急性胰腺炎、胰腺癌、肝病、肾功能障碍等恶性疾病的诊断有一定的临床参考价值。本专利技术即针对淀粉酶活性的快速检测。目前，淀粉酶的活性检测方法很多，如碘-淀粉比色法、对-硝基苯麦芽七糖苷法等，其中后者已有商品化的试剂盒销售。这些检测手段均较为繁琐复杂，需要借助大型仪器，经过多步操作才能完成。因此，寻找更简便、快速的酶活检测方法对于目前发展迅速的个性化生物医学诊断技术具有较大的实际意义。近年来，纳米技术已深深地渗透到生物医学领域，有望为之提供优异的分子探针工具。纳米结构所具有的小尺寸效应、量子效应、表面效应等使纳米材料呈现出独特的光学、电子学、磁学等性能，在高效催化、微电子器件、磁介质及医药新材料等领域有广阔的应用前景。生物纳米技术基于纳米材料科学、化学与生物技术的有机结合，对基因治疗、生物医学、生物纳米结构的构建及生物大分子结构与功能关系的研究均具有重要意义。在各类生物纳米技术中，基于比色法的纳米检测技术(或称作可视化检测)是一个亮点。该检测通过肉眼即可观察，不仅操作方便，而且成本低廉。其中最典型的纳米结构为金纳米粒子。 根据金纳米粒子聚集时的颜色改变(红色到蓝紫色)，可以设计各式各样由之介导的聚集过程，用于检测核酸/适体、蛋白甚至细胞在内的分析物。从原理上看，由于纳米颗粒的稳定性受颗粒间静电作用、立体位阻作用和静电-立体位阻联合作用等控制，一旦维持稳定的主导作用受到破坏，纳米颗粒就容易引起聚集。常用聚集模式包括交联和非交联两大类， 前者利用生物功能化的纳米颗粒相互吸引后碰撞产生聚集，用于分子检测通常需要耗费大量时间。例如，基于金纳米粒子聚集的可视化DNA探针杂交检测通常需要几个小时才能完成。而非交联聚集体系利用外来因素破坏纳米颗粒表面的稳定基团，能大大缩短检测时间， 实现快速检测。该模式为本专利技术所采用。在过去的十年中，以天然高分子聚合物(如生物多糖、蛋白质)等为前驱材料，应用“绿色”化学手段合成纳米材料成为一种趋势。制备的材料具有化学性质稳定、生物相容性好等特点，因而在环境保护、生物医学等领域受到青睐。基于这类纳米材料可以设计选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能适应复杂体系的新型检测方法，为发展生物检测技术开辟了广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术提供一种快速、简单且成本低廉的。针对现有酶活检测中步骤较繁杂、检测时间长、所用试剂众多、成本偏高等缺点， 本专利技术提出了一种由淀粉稳定Cd-VIA族纳米颗粒的聚集响应作为考察指标来检测淀粉酶活性的方法。该酶活检测方法简单实用，采样量少，检测快速，成本低廉，能满足日常检验的灵敏度需求，可应用于常规生物医学领域的唾液淀粉酶活性检测，其技术方案如下一种，包括如下步骤第一步，取浓度为0. 5 2. Omg/mL、温度为25°C的淀粉溶液，向50mL淀粉溶液中加入0. 04 0. 2mmol Cd盐和0. 02 0. Immol VIA族元素的钠盐，随后在60 90°C下加热1 3小时，合成淀粉稳定的Cd-VIA族纳米颗粒；第二步，以12000转/分钟的速度离心第一步所得样品，弃去上清液，向沉积物中按沉积物水的重量比为1 600加入去离子水，超声波重新分散获得棕红色胶体溶液产品；第三步，将2 μ L不同活性的商品化标准淀粉酶样品、25 μ L 0. 2mol/LpH5. 5 8. O 磷酸缓冲液和35 μ L去离子水加入0. 5mL规格的透明塑料离心管中，得预备混合溶液，向该预备溶液加入38 μ L第二步所得产品后立即开始计时，观察并记录与不同活性的商品化标准淀粉酶样品一一对应的混合液中开始出现浑浊时所需消耗的时间，以酶活性的倒数为横坐标、消耗时间为纵坐标，根据上述数据作图，并采用线性拟合获得校准关系式t = 25. 23+166. 95/Activity,t为所需消耗的时间，单位秒；Activity为酶活性，单位活性单位/mL ；第四步，将2 μ L活性未知的淀粉酶样品、25 μ L 0. 2mol/L pH5. 5 8. O磷酸缓冲液和35 μ L去离子水混合加入0. 5mL规格的透明塑料离心管中，得预备混合溶液，向该预备溶液加入38 μ L第二步所得产品后立即开始计时，观察并记录混合液中出现浑浊时所需消耗的时间，将此时间代入第三步所得校准关系式，计算出未知的酶活性。有益效果传统的淀粉酶活检测方法(如对-硝基苯麦芽七糖苷法)的标准步骤较为繁杂， 所需试剂众多，且普遍需要借助如分光光度计、紫外可见光谱仪或荧光光谱仪等光学仪器来作定量手段，通常所需的检测时间在半小时以上。实验结果表明，本专利技术采用的淀粉稳定Cd-VIA族纳米颗粒制备方法成熟，合成与浓缩纯化等操作均较简单，无需苛刻的反应设备，可在较短时间(0.5 7. 5分钟)内获得符合要求的产品；利用酶作用下均勻分散的特定纳米颗粒丧失稳定性而迅速产生浑浊作为考察指标来检测人唾液淀粉酶活性，反应前后对比度明显，容易判断计时终点。与传统方法相比，本方法简单实用、用样量少、检测快速、灵敏度高。尤其值得注意的是，本专利技术以混合液出现浑浊的时间为量化指标，该技术可以在不借助任何现代化仪器的条件下完成酶活检测，降低了检测成本。附图说明下面结合附图说明本专利技术的实施例。本专利技术保护范围不以实施例为限。图1是该纳米颗粒(左)及其在加入淀粉酶后出现浑浊瞬间(右)的照片。图2是纳米颗粒(实线)在加入淀粉酶后出现浑浊(虚线)时的粒径分布。图3是浑浊出现时间与淀粉酶活性倒数的线性关系曲线。具体实施例方式本专利技术采用的α -淀粉酶(EC. 3. 2. ll，25U/mg)购于 Sigma 公司(St. Louis, MO, USA)，淀粉和其它试剂购于中国上海国药集团化学试剂有限公司，去离子水由Millipore 公司Milli-Q集成纯水系统制造。通过调节0. 2mol/L Na2HPO4和0. 2mol/L NaH2PO4的比例来配制0. 2mol/L pH 5. 5 8. 0磷酸盐缓冲溶液。实施例1淀粉稳定的CdTe纳米颗粒的制备本实施例合成淀粉稳定的CdTe纳米颗粒。25°C下，称量25 IOOmg淀粉，加入 50mL去离子水中，其中淀粉的重量可以是25 IOOmg中的任一数值。煮沸并保持15min，淀粉完全溶解，得到无色透明溶液。冷却至25°C后倒入50mL三颈烧瓶，搅拌下加入0. 2mmol 的CdCl2水溶液。通入氮气，保持气体流量为60mL/min。15min后，加入0. 2mL lmol/L NaOH 溶液，此时混合液PH 8. 0。继续反应15min，以lmL/min速度缓慢加入ImL 0. lmol/L NaHTe溶液。溶液颜色立刻由无色变为红棕色。升温至85°C继续反应lh，得深棕色透明溶液。该溶液用12000转/分钟高速离心，得棕色沉积物。向沉积物中按沉积物水的重量比为1 600加入去离子水，利用超声波G0W，40KHz)作用;3min，分散到去离子水中备用。 此产品浓度为1. 6m本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于Ｃｄ－ＶＩＡ族纳米颗粒检测淀粉酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：第一步，取浓度为０．５～２．０ｍｇ／ｍＬ、温度为２５℃的淀粉溶液，向５０ｍＬ淀粉溶液中加入０．０４～０．２ｍｍｏｌ Ｃｄ盐和０．０２～０．１ｍｍｏｌ ＶＩＡ族元素的钠盐，随后在６０～９０℃下加热１～３小时，合成淀粉稳定的Ｃｄ－ＶＩＡ族纳米颗粒；第二步，以１２０００转／分钟的速度离心第一步所得样品，弃去上清液，向沉积物中按沉积物∶水的重量比为１∶６００加入去离子水，超声波重新分散获得棕红色胶体溶液产品；第三步，将２μＬ不同活性的商品化标准淀粉酶样品、２５μＬ ０．２ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ５．５～８．０磷酸缓冲液和３５μＬ去离子水加入０．５ｍＬ规格的透明塑料离心管中，得预备混合溶液，向该预备溶液加入３８μＬ第二步所得产品后立即开始计时，观察并记录与不同活性的商品化标准淀粉酶样品一一对应的混合液中开始出现浑浊时所需消耗的时间。以酶活性的倒数为横坐标、消耗时间为纵坐标，根据上述数据作图，并采用线性拟合获得校准关系式：ｔ＝２５．２３＋１６６．９５／Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｔ为所需消耗的时间，单位：秒；Ａｃｔｉｖｉｔｙ为酶活性，单位：活性单位／ｍＬ；第四步，将２μＬ活性未知的淀粉酶样品、２５μＬ ０．２ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ５．５～８．０磷酸缓冲液和３５μＬ去离子水混合加入０．５ｍＬ规格的透明塑料离心管中，得预备混合溶液，向该预备溶液加入３８μＬ第二步所得产品后立即开始计时，观察并记录混合液中出现浑浊时所需消耗的时间，将此时间代入第三步所得校准关系式，计算出未知的酶活性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜晖，王雪梅，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84
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