本发明专利技术涉及一种大豆逆境相关转录因子ERF及其编码基因与应用，属于植物基因工程领域，大豆逆境相关转录因子ERF的其氨基酸序列为SequenceN0.2，其编码基因的核苷酸序列为SequenceN0.1。本发明专利技术克隆了一个逆境诱导相关的大豆GmERF6转录因子基因，研究该基因在大豆中的表达模式及转录调节活性，比较了野生型和转GmERF6基因拟南芥的抗旱性，为其有效应用提供依据，对提高植物的抗逆性，特别是培育抗旱大豆品种具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆逆境相关转录因子ERF及其编码基因与应用。
技术介绍
大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，同时也是重要的家畜饲料和工业原料，在医学上也有很大价值。然而生物和非生物胁迫，包括病害、盐害、低温及干旱等都对大豆的生长和发育产生极为不利的影响，从而导致大豆产量降低，造成严重的经济损失。因此，阐明大豆对逆境的响应机制，鉴定逆境相关的重要基因并利用它们来提高大豆的抗逆性显得尤为重要。植物可以通过调节体内一系列基因的表达或合成大量相关胁迫蛋白来适应环境。 其中，转录因子由于可以调节多个基因的表达而在植物的胁迫响应中发挥重要作用，逐渐成为人们的研究热点。ERF转录因子分属于植物中特有的AP2/ERF转录因子大家族中的ERF 亚家族，最初从烟草中分离得到。它们表达的蛋白共同含有1个保守的由58或59个氨基酸组成的ERF结合域，此结合域由3个β折叠和1个α螺旋组成，可以特异的结合GCC和 DRE/CRT元件，而这些元件通常分别位于植物的病程相关蛋白基因和干旱、冷诱导相关基因的启动子中。ERF正是通过调节这些基因的表达从而参与到植物的生物胁迫和非生物胁迫中去。植物的逆境响应被多条信号途径所调节，其中，乙烯、水杨酸、茉莉酸、脱落酸等逆境胁迫信号物质通常会调节ERF的表达，这四个信号分子通过ERF转录因子参与了不同防御相关基因的表达。番茄JERF3既是GCC box结合蛋白，又能识别DRE元件，在番茄中能被乙烯、茉莉酸、低温、高盐和脱落酸诱导，同时能提高转基因烟草的耐盐性。烟草的Tsil不仅在乙烯、NaCl、ABA和水杨酸处理的叶片中表达，还可以被干旱和水淹诱导表达。Tsil的超表达提高了植株对高盐和病原的抗性。木花生中的JcERF的表达可以被高盐、干旱、乙烯和机械伤害诱导，但不被ABA诱导，在拟南芥中超表达JcERF增强了植物对盐和寒冷的抗性。目前，已从拟南芥、烟草、番茄、辣椒、水稻、小麦、棉花等不同植物中克隆到大量 ERF基因，但在大豆中仅报道过3个ERF的功能，它们均参与到大豆的胁迫响应中去，在提高植物抗逆性方面发挥积极的调控作用。单子叶植物和双子叶植物中均可能存在大量的ERF 转录因子，鉴于ERF在植物应对逆境中发挥的重要作用，因此，对大豆ERF家族中其他的成员作进一步的鉴定与应用有利于大豆胁迫抗(耐)性的改良。
技术实现思路
本专利技术提供一种大豆逆境相关转录因子ERF及其编码基因与应用。本专利技术所提供的大豆逆境相关ERF转录因子来源于大豆品种吉林32，由吉林省农科院富健研究员馈赠，地址吉林省长春市彩宇大街1363号吉林省农业科学院；命名为 GmERF6。大豆逆境相关转录因子ERF的氨基酸序列为kquence NO. 2。所述大豆逆境相关转录因子ERF的编码基因的核苷酸序列为kquence NO. 1。所述的大豆逆境相关转录因子ERF在提高植物的抗旱性中的应用。序列kquence NO. 1由582个碱基组成、Sequence NO. 2由193个氨基酸残基组成，含一个ERF结构域。。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的GmERF6 的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱抗性提高的转基因植株。使用本专利技术的基因构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。 携带有本专利技术GmERF6的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本专利技术的有益效果是本专利技术克隆了一个逆境诱导相关的大豆GmERF6转录因子基因，研究该基因在大豆中的表达模式及转录调节活性，比较了野生型和转GmERF6基因拟南芥的抗旱性，为其有效应用提供依据，对提高植物的抗逆性，特别是培育抗旱大豆品种具有重要意义。附图说明图1是本专利技术GmERF6基因的PCR扩增结果图2是本专利技术GmERF6重组蛋白的表达图3是本专利技术GmERF6基因逆境诱导表达模式图4是本专利技术GmERF6基因组织表达模式图5是本专利技术报告质粒、效应质粒载体结构示意图6是本专利技术GmERF6基因转录调节活性分析图7是本专利技术GmERF6基因在部分T2代转基因拟南芥中的PCR鉴定结果图8是本专利技术T3代转基因拟南芥中GmERF6下游基因半定量结果图9A是本专利技术野生型拟南芥干旱处理结果图9B是本专利技术T3代转基因拟南芥干旱处理结果 图。图10是本专利技术野生型拟南芥和T3代转基因拟南芥干旱处理后失水率测定结果具体实施例方式实施例1 :GmERF6基因的克隆及序列分析大豆RNA的提取及cDNA的合成用RNAplant plus Reagent (购自TIANGEN)提取大豆吉林 32 叶片总 RNA，用 M-MLV reverse transcriptase (RNase H_)(购自 TaKaRa)进行反转录，合成cDNA。引物的设计与合成将大豆品种吉林32的3个时期O0、30和50天)未成熟胚表达谱测序所得序列(华大基因完成)输入NCBI中进行Blast比对，获得一个与植物中 ERF转录因子蛋白序列同源性较高的未知cDNA序列。根据已获得的未知cDNA序列，其核苷酸序列如 kquence NO. 1 所述，设计合成引物，F :5，-CTTCCTACTCCTCCCTTTCAC-3’，R 5，-CGTAGTAGTGTTCCCAGATGC-3，。以上述cDNA为模板，按照以下反应体系及条件进行PCR扩增25 μ L 体系，内含 10XPCR Buffer2. 5μ L,2. 5mM dNTP mix 2 μ L，10 μ M 的弓丨物 F 禾口引物R各1pL，cDNA IyL, EX Taq (购自TaKaRa) 0. 3 μ L，补去离子水至25 μ L。反应条件 预变性 94°C 8min ；94°C 40s, 60°C 40s, 72°C lmin,30 个循环；72°C延伸 8min。将上述扩增片段回收后与克隆载体PMD18-T (购自TaKaRa)进行连接，鉴定后送华大基因测序，验证序列正确。经PCR扩增得到包含有GmERF6基因全长OFR的序列，编码一个由193个氨基酸残基组成的蛋白质，包含一个保守的ERF结合域，两个核定位信号和一个EAR抑制元件。实施例2 :GmERF6基因在原核中的表达根据GmERF6基因序列设计合成引物，并在其上、下游引物中分别引入 Sac I 和 Hind III 酶切位点，F :5 ‘ -GAGCTCATGGCCCCAAGAGACAGC-3 ‘ ；R 5' -TTCGAATCAGGCAACCTCCGGGAG-3‘。以pMD18-T_GmERF6质粒为模板，进行PCR扩增。将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(购自TIANGEN)纯化后，用Mc I和Hind III (各种限制性内切酶均购自TaKaRa)双酶切，回收纯化后，与同样用Mc I和Hind III双酶切的pET28a(购自Novagen)载体连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌(E. coli)DH5a 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种大豆逆境相关转录因子ＥＲＦ，其特征在于：其氨基酸序列为Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎ０．２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆钰，翟莹，李景文，王英，闫帆，雷婷婷，苏连泰，李艳杰，张鑫生，王洪预，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82
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