一种蛇蟾三肽的工业化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种蛇蟾三肽的工业化制备方法，本发明专利技术的技术方案包括以下步骤：以Wang树脂为起始原料，TBTU/HOBt为缩合剂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，最后一个氨基酸使用Boc-Arg-OH·HCl，获得保护的三肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得粗品，粗品经制备型C18高效液相柱进行分离纯化，冻干后，制得蛇蟾三肽精品。本发明专利技术的方法，降低了生产成本，简化了工艺流程。切肽后用乙醚沉淀粗品，避免使用剧毒的氟化氢，三废污染少。采用C18柱进行分离纯化，避免使用三氟乙酸，减小三废。纯化收率在50%以上，每步接肽收率均在98%以上，切肽后收率为88%，分离纯化收率为58%，总收率约为51%。本发明专利技术的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛇蟾三肽(R⑶肽)的制备方法，具体涉及蛇蟾三肽的固相多肽合成制备方法。
技术介绍
中文名蛇蟾三肽英文名为RDG结构式为 Arg-Gly-Asp-OH 分子式=C12H22N6O6 分子量346. 3 CAS 号99896-85-2RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp-OH)的短肽，作为整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用。蛇蟾三肽临床用于免疫增强剂，艾滋病早期治疗、慢性肝炎、恶性肿瘤、手术及严重感染，还可用于糖尿病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾小球肾炎、多发性硬化等自身免疫性疾病，还具有抗衰老作用等。由于RGD肽在人体内的半衰期较短，因此为了获得满意的治疗效果，往往需要采用较大剂量。因此降低RGD肽的生产成本，就具有重要的意义。目前的文献只有研究及应用的报导，但是未见其生产制备的报导。如果参照《化工进展》2003年第2期153-156，“固相合成胸腺五肽的研究进展”所公开的技术，接肽收率低，生产成本高，工艺复杂，而且使用剧毒的氟化氢和三氟乙酸，三废污染严重，难以进行工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开。本专利技术提出了一条较适当的路线，使用固相法合成蛇蟾三肽，以克服现有技术存在的上述缺陷，且收率较高。本专利技术的技术方案包括如下步骤(1)以高取代的Wang树脂为起始原料，以Fmoc和Boc保护相结合的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次接上Fmoc-Asp (tBu) -0H、Fmoc-Gly-0H，最后一个氨基酸采用 Boc-Arg-OH · HCl ；(2)将切肽试剂加入步骤(1)所得的产物中进行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)将步骤(2)所得的粗品采用C18柱进行分离纯化，获得目标产物。按照本专利技术优选的方案，以高取代的Wang树脂为起始原料，以Fmoc和Boc 保护相结合的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次接上Fmoc-Asp (OtBu)-0H、 Fmoc-Gly-OH，最后一个氨基酸采用Boc-Arg-OH · HCl的方法包括如下步骤(1)制备 Fmoc-Asp (tBu)-树脂将Wang树脂(1. 5-2. Ommol/g)用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干；加入溶解于DMF中的Fmoc-Asp (tBu)-OH和TBTU/HOBt，25 27°C进行接肽反应1小时，抽干，分别用DMF、乙醇DMF分别洗涤，抽干，获得Fmoc-Asp (tBu)-树脂；(2)制备Fmoc-Gly-Asp (tBu)-树脂在上述Fmoc-Asp (tBu)树脂中，加入脱帽试剂，25 27°C脱帽反应15 45分钟，分别用 DMF、乙醇洗涤，抽干。加入溶解于DMF的Fmoc-Gly-OH、TBTU, HOBT和NMM，25 27°C进行接肽反应1小时，抽干，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Gly-Asp (tBu)-树脂； 所说的脱帽试剂为六氢吡啶/ DMF=25-27/75-73，体积比；下同；(3)制备Boc-Arg-Gly-Asp-树脂在上述Fmoc-Gly-Asp (tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，25 27°C反应15 45分钟，分别用 DMF、乙醇洗涤，抽干。加入溶解于DMF的Boc-Arg-OH · HC1.DIC和HOBT，25 27°C进行接肽反应8、小时，其余操作同(2)，获得Boc-Arg- Gly-Asp (tBu)-树脂； 按照本专利技术优选的技术方案，切肽包括如下步骤将切肽试剂加入Boc-Arg-Gly-Asp (tBu)-树脂，20 22°C进行切肽反应2. 5 4. O小时， 加入乙醚沉淀，过滤，收集沉淀物，用乙醚洗，I32O5真空干燥，得粗品； 所说的切肽试剂为TFA/H20/TIS = 700ml/150ml/150ml ； 按照本专利技术优选的技术方案，分离纯化包括如下步骤将粗品溶于水中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相0. 15mol/L醋酸乙腈(95 5)；流速为400-650ml/min ；检测波长为220nm ；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后，采用常规的方法脱盐，冻干，获得成品，总收率51%。由上述公开的技术方案可见，本专利技术采用Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个氨基酸采用 Boc-Arg-OH · HCl的方法，降低了生产成本，简化工艺，切肽后乙醚沉淀粗品，避免使用剧毒的氟化氢，三废污染少。采用C18柱进行分离纯化，避免使用三氟乙酸，减小三废，纯化收率在50%以上，每步接肽收率均在98%以上，切肽后收率为88%，分离纯化收率为58%，总收率约为51%。本专利技术的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。具体实施例方式实施例和前述过程中所采用的原料列表如下权利要求1.本专利技术是，包括如下步骤(1)以高取代的Wang树脂为起始原料，以Fmoc和Boc保护相结合的氨基酸为单体， 以TBTU/HOBt为缩合剂，依次接上Fmoc-Asp (tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，最后一个氨基酸采用 Boc-Arg-OH · HCl ；(2)将切肽试剂加入步骤(1)所得的产物中进行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3 )将步骤(2 )所得的粗品采用C18高效液相柱进行分离纯化，获得目标产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以高取代的Wang树脂为起始原料，以Fmoc和Boc保护相结合的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次接上 Fmoc-Asp (OtBu)-0H、Fmoc-Gly-0H，最后一个氨基酸采用Boc-Arg-OH 'HCl的方法包括如下步骤(1)制备Fmoc-Asp (tBu)-树脂将Wang树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干；加入溶解于DMF中的 Fmoc-Asp (tBu)-OH和TBTU/HOBt,于25 27 °C进行接肽反应0. 5 1. 5小时，抽干，分别用 DMF、乙醇DMF分别洗涤，抽干，获得Fmoc-Asp (tBu)-树脂；其中Wang树脂的取代度为 1. 3^2. Ommol/g ；接肽反应温度为25 27°C，接肽反应时间为0. 5^1. 5小时；(2)制备Fmoc-Gly-Asp (tBu)-树脂在上述Fmoc-Asp (tBu)树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，25 27°C反应15 45分钟，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干；加入溶解于DMF的Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT和NMM，于25 27°C进行接肽反应0. 5 1. 5 小时，抽干，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Gly-Asp (tBu)-树脂；所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为25-27% ；六氢吡啶的反应温度为25 27°C ； 接肽反应温度为25 27°C，接肽反应时间为0. 5^1. 5小时；(3)制备Boc-Arg-Gly-Asp (tBu)-树脂在上述Fmoc-Gly-Asp (tBu)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，25^27°C反应15 45分钟，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干；加入Boc-Arg-OH 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　本专利技术是一种蛇蟾三肽的工业化制备方法，包括如下步骤：　　（１）以高取代的Ｗａｎｇ树脂为起始原料，以Ｆｍｏｃ和Ｂｏｃ保护相结合的氨基酸为单体，以ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ为缩合剂，依次接上Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ，最后一个氨基酸采用Ｂｏｃ－Ａｒｇ－ＯＨ·ＨＣｌ；　　（２）将切肽试剂加入步骤（１）所得的产物中进行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；　　（３）将步骤（２）所得的粗品采用Ｃ１８高效液相柱进行分离纯化，获得目标产物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周逸明，崔颀，蔡华成，
申请(专利权)人：上海苏豪逸明制药有限公司，周逸明，崔颀，
类型：发明
国别省市：31