日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR功能抑制肽及其应用，属于生物技术的分子生物学与生物化学等技术领域。本发明专利技术提供了抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）活性的抑制肽，所述的抑制肽氨基酸序列分别为：JIPDys1：WPHNWWPHFKVK；JIPDys2：LHAETRSAMHRT；JIPDys3：YTMPSLTLYAMG；及所述的SjTGR活性抑制肽在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。本发明专利技术筛选到的三条噬菌体展示肽对日本血吸虫生存必须蛋白分子-硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）的硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶及谷氧还蛋白活性均具有抑制作用；为开发新的血吸虫病治疗药物奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及采用噬菌体展示技术从噬菌体展示肽库中筛选能抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)酶活性的抑制肽，可破坏血吸虫生化代谢过程中的氧化还原平衡，导致血吸虫死亡，适用于新的血吸虫病治疗药物的研究。属于生物技术的分子生物学与生物化学等
技术介绍
血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患病，全球有76个国家有血吸虫病流行，有约6亿人口受到血吸虫感染的威胁，血吸虫病人有2000多万。经过60年不懈努力，我国仍有约2. 4亿人口受血吸虫感染威胁，有血吸虫病人36万余人，血吸虫病流行的自然条件依然存在。由于仍没有可用的血吸虫病疫苗，血吸虫病的防治目前主要依靠药物治疗。吡喹酮是当前唯一的血吸虫病治疗药物，由于长期大规模的反复使用，曼氏血吸虫已出现了抗吡喹酮的耐药株，而在我国流行的日本血吸虫亦出现了对吡喹酮敏感性下降的现象，给未来血吸虫病的防治工作带来了严重的挑战。因此，开发新血吸虫病治疗药物，应对吡喹酮抗药性的出现是当前血吸虫病防治科研的紧迫任务。生命过程是由一系列的生化代谢过程所组成，在这个过程中，生物体产生维持生命过程所必须的物质，并排除生物体内的毒性物质，从而保持体内平衡，一旦这种平衡被破坏就会导致生物死亡。因此，干扰血吸虫生命过程中一些重要蛋白分子的功能，使其失去活性，则可能破坏血吸虫的某一重要生化代谢过程，导致血吸虫死亡，达到治疗血吸虫病的目的，是新药开发的有效策略。生命过程中的这些重要蛋白分子(亦称为生命过程必须的蛋白分子，essential molecule)是新药开发重要的潜在靶标分子。已有的研究成果显示血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)是血吸虫氧化还原平衡代谢过程中的一个必须蛋白分子，抑制血吸虫SjTGR的表达或功能，虫体因不能抵抗氧化损伤而死亡，是一个非常有潜力的抗血吸虫感染新药开发靶标，开发抗血吸虫SjTGR 分子酶活性的抑制剂已成为血吸虫治疗新药研究的热点。蛋白酶抑制剂包括了化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。Sayed等筛选到能有效抑制曼氏血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SmTGR)蛋白活性的化学抑制剂，如噁二唑、 磷酰胺、金诺芬。宋丽君等筛选到能抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)的化学抑制剂金诺芬、化合物4N等。这些化学抑制剂都具有一定的治疗血吸虫病疗效，但其副作用大，目前还没有进入临床研究阶段。除了化学抑制剂外，肽类和抗体是蛋白酶的另一类重要的功能抑制剂，已成为许多重要疾病的有效治疗药物，肽类与抗体类药物是近十年全球成长最快的医药产品。抗体由于其分子量大，不能进入细胞与目标靶分子直接作用，且易引起免疫中和与排异反应，限制了其应用价值。肽类药物因其分子量小，能直接进入靶细胞中直接抑制目标靶分子的功能，使用剂量小，疗效明确，具有广泛的应用前景。噬菌体展示肽库是将一组人工设计合成的编码由7-12个氨基酸组成的短肽的基因序列与噬菌体M13的外壳蛋白ρ III基因的N未端融合，使人工设计的短肽表达、展示在噬菌体外壳蛋白表面，并保持其空间构象。这种肽展示库包涵了 IO9种以上的短肽，可以模拟自然界可能存在各种蛋白结构，包括各种蛋白酶的底物结构。利用酶与底物亲和结合的特性，可以从噬菌体展示肽库中筛选到与蛋白酶特异性结合的短肽，为新药的开发奠定基础。 噬菌体展示技术将基因型与表型，分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合起来，实现了基因型到表型的转换，是肽类药物开发的一项革命性新技术。
技术实现思路
本专利技术目的是利用噬菌体展示技术筛选能与日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)特异性结合，抑制其酶活性，破坏血吸虫氧化还原代谢平衡的抑制肽，可用于血吸虫病治疗新药的研究。本专利技术的技术方案抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)活性的抑制肽，所述的抑制肽其名称与氨基酸序列分别为JIPDysl =WPHNWffPHFKVK ；BP SEQ NO. 1: Trp Pro His Asn Trp Trp Pro His Phe Lys Val Lys ；JIPDys2 :LHAETRSAMHRT ；即 SEQ NO. 2: Leu His Ala Glu Thr Arg Ser Ala Met His Arg Thr ；JIPDys3 :YTMPSLTLYAMG ；BP SEQ NO. 3: Tyr Thr Met Pro Ser Leu Thr Leu Tyr Ala Met Gly ；所述SjTGR活性抑制肽的氨基酸序列演变而产生的其它具有抑制SjTGR活性的肽段。所述的SjTGR活性抑制肽在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。本专利技术用于筛选上述三种抑制肽的结合蛋白为重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)硒蛋白。所述的SjTGR蛋白分子的氨基酸序列SEQ ID NO :4，保持有至少90%的同源性。所述的SjTGR蛋白分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO :5。所述的重组SjTGR硒蛋白分子(SjTGRsec)的表达，在于首先将编码SjTGR蛋白分子核苷酸片段SEQ ID NO :5的3’未端与与大肠杆菌中的硒代半胱氨酸插入序列SEQ ID NO 6的5，未端通过PCR的方法连接在一起形成一个嵌合基因序列SEQ ID NO :7。然后通过插入到一种表达载体pET-41a中形成重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a，然后将重组表达载体SjTGRsec/pET-41a转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21 (DE3)中表达重组SjTGR硒蛋白。所述的重组SjTGR硒蛋白的制备方法，包括转录、翻译、蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。本专利技术为了获得纯化的重组SjTGR硒蛋白，根据SjTGR硒蛋白中含有ADP结合域的结构特征，采用ADP-s印harose 4B胶亲和层析的方法进行纯化制备。所述重组SjTGR硒蛋白应用包括但不限于1)通过蛋白酶活性抑制的方法筛选、 鉴定该蛋白酶抑制剂，用于血吸虫病的治疗。包括但不局限于化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。2)制备血吸虫感染疫苗。本专利技术优选的表达质粒是pET_41a (美国Novagen公司产品)，适合在大肠杆菌工程菌中表达。但是，本专利技术中的SjTGR硒蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。具体地，该表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述的tac启动子，优选的启动子为T7。本专利技术在表达SjTGR硒蛋白时使用质粒pSU ABC为硒蛋白表达的辅助质粒，为 SjTGR硒蛋白中硒代半胱氨酸的掺入提供k、Sel B和C等辅助因子。本专利技术提供构建SjTGR硒蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。首先克隆获得编码SjTGR的核苷酸序列。编码SjTGR蛋白氨基酸序列的核苷酸序列与序列SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。具体地，通过RT-PCR技术，从血吸虫mRNA中反转录合成编码SjTGR蛋白核苷酸片段。将SjTGR基因片段克隆到TA克隆载体pGEM-T中构建重组质粒SjTGR/pGEM_T进行DNA 序列分析，确定其基因序列的正确性。然后SjTGR基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶ＳｊＴＧＲ活性的抑制肽，其特征在于所述的抑制肽氨基酸序列分别为：ＳＥＱ ＮＯ．１；即ＪＩＰＤｙｓ１：ＷＰＨＮＷＷＰＨＦＫＶＫ；ＳＥＱ ＮＯ．２；即ＪＩＰＤｙｓ２：ＬＨＡＥＴＲＳＡＭＨＲＴ；ＳＥＱ ＮＯ．３；即ＪＩＰＤｙｓ３：ＹＴＭＰＳＬＴＬＹＡＭＧ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余传信，宋丽君，殷旭仁，王玠，钱春艳，梁幼生，
申请(专利权)人：江苏省血吸虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：32
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