本发明专利技术涉及一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，所述的培养基的成分是：大豆蛋白胨、工业酵母抽提物、KCl、葡萄糖、MgCl2、NaAc、苯丙氨酸、调pH；培养基的配制方法包括以下步骤：a、初始培养基的配制；b、配制NaAc母液；c、配制苯丙氨酸母液；d、制成培养基。用于欧文氏菌制备紫杉醇，得到紫杉醇的产量为101.5μg/L～103.0μg/L；生产紫杉醇的周期为3～4天，缩短了生产周期，提高了产量；且本发明专利技术所采用的原料廉价易得，从而也大大降低了生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种培养基及其配制方法和应用，尤其涉及一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，属于生物
技术介绍
紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是红豆杉树种中发现的一种天然的抗癌药物，它对乳腺癌、肺癌和白血病细胞等具有强杀伤作用。Wani和Wail等人在J.AM.Chem.Soc.93,2325, (1971)中首次报道了紫杉醇的分离及理化特征，并确定了其优良的抗癌活性，引起了人们广泛的关注。并于1992年底被美国FDA正式批准作为治疗晚期卵巢癌药物进入市场，1993年底被批准用于治疗乳腺癌。此后，临床上陆续发现紫杉醇对卡波济氏肉瘤、结、直肠癌、膀胱癌和转移性乳腺癌等一系列棘手肿瘤均展现出一定的疗效。另外，由于紫杉醇副作用小，药效显著，因此，紫杉醇已成为抗肿瘤的主流药物之一，随之需求量也迅速增加。现有的紫杉醇的主要制备方法是直接提取法和生化半合成法。直接提取法主要是从红豆杉树中提取得到，但由于紫杉醇在整个红豆杉树木中的含量是极低和其溶解性差。从而使该方法生产紫杉醇需要消耗大量的红豆杉树原料。而生化半合成法的应用也是基于对植物红豆杉生成紫杉醇的分子生物学研究的结果，利用生物酶类将红豆杉原料进行处理，使较易溶于水的紫杉烷环和C-13位侧链中间体得到一定程度富集，提取前体，利用酶法或化学法将这些前体合成紫杉醇。生化半合成法虽然在一定程度上提高了紫杉醇产量，但仍然需要消耗大量红豆杉树原料。由于植物生长周期长，且种植严重受自然条件限制，另一方面，红豆杉植物在我国和世界各国的资源也很少，从而，使得生产紫杉醇的成本极高。为此，制药界和学术界一直在寻找一种更好的原料及方法，来代替现有技术。1993年，Stierle等人从太平洋红豆杉的韧皮部分离得到一株次级代谢物中含有紫杉醇的内生真菌，使得利用真菌发酵生产紫杉醇成为可能。但是目前报道的生产紫杉醇的菌株大多是红豆杉共生真菌，导致紫杉醇的产量很低；且菌丝体不发达，并不适于发酵生产。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中所存在的缺陷，提出了一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基。本专利技术的目的是通过下列技术方案来实现:一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，所述的培养基中包括以下质量浓度的成分组成:大豆蛋白胨:15 25g/L ;工业酵母抽提物:4.5 5.5g/L ；NaCl:0.10 1.0g/L ；KC1:0.05 0.15g/L ;葡萄糖:1.0 8.0g/L ；MgCl2:0.5 1.5g/L ；NaAc:0.05 0.15g/L ;苯丙氨酸:2.0X 1(Γ4 8.0X l(T4g/L ；pH:6.0 7.00根据以上本专利技术所述的培养基，其中大豆蛋白胨和葡萄糖为欧文氏菌培养提供主要的碳源、氮源和生长因子；其中所含的NaCl、KCl和MgCl2,主要是提供欧文氏菌生长所需要的矿物质；其中所述的pH值可以通过调节ΚΗΡ04/ΚΗ2Ρ04缓冲剂来控制，因为微生物在生长繁殖或代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成或积累，会导致培养基PH值发生变化，若不对pH值进行控制，pH值过高或过低，都会导致微生物生长速度降低或代谢产物产量降低；如果没有以上所述的碳源、氮源、生长因子和矿物质及pH值环境，那么欧文氏菌就不能通过培养生长繁殖来实现；而NaAc和苯丙氨酸，都是合成紫杉醇的必须原料，如果没有这两种原料，就不能合成紫杉醇，从而不能实现本专利技术的目的。作为优选，所述的培养基中包括以下成分及质量浓度:大豆蛋白胨:18 22g/L ;工业酵母抽提物:4.8 5.2g/L ；NaCl:0.30 0.80g/L ；KC1:0.08 0.12g/L ;葡萄糖:3.0 5.0g/L ；MgCl2:0.8 1.2g/L ；NaAc:0.02 0.13g/L ;苯丙氨酸:3.0 X 1(Γ4 7.0Xl(T4g/L ；PH:6.3 6.8。进一步的优选，所述的培养基中包括以下成分及质量浓度:大豆蛋白胨:20g/L ;工业酵母抽提物:5g/L ；NaCl:0.5g/L ；KC1:0.lOg/L ;葡萄糖:4.0g/L ；MgCl2:1.0g/L ；NaAc:0.lOg/L ;苯丙氨酸:5.0X 10 4g/L ；pH:6.5。根据以上所述的培养基，其中所含的NaAc和苯丙氨酸是合成紫杉醇的必须原料，如果所含的质量浓度过少，则会使合成的紫杉醇产量过低；若所含的质量浓度过高，一方面，合成紫杉醇的产量反而会降低，另一方面，在产量降低的情况下，提高其所含的质量浓度，从而使所需的成本增高。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基的制备方法，该方法包括以下步骤:a、初始培养基的配制:称取大豆蛋白胨；工业酵母抽提物；NaCl ；KC1 ;葡萄糖；MgCl2 ;将称量好的成分和水混合均匀后，调节pH，灭菌，制成初始培养基；b、称取NaAc，用水配制成母液，灭菌后，备用；C、称取苯丙氨酸，用水配制成苯丙氨酸母液，灭菌后，备用；d、将欧文氏菌接种于步骤a中所述的初始培养基后，加入步骤b中所述的NaAc母液，发酵8 20小时后，再加入苯丙氨酸母液，制成培养基。在上述用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基的制备方法中，所述的灭菌处理是采用高压蒸汽灭菌法。要获得纯微生物培养，就必须避免杂菌污染，所以必须对培养基进行严格的灭菌处理。本专利技术采用的欧文氏菌是现有普通的欧文氏菌，如美国专利技术专利(公开号:US5561055A)公开的欧文氏菌，保藏的编号为:ATCC:55669。该欧文氏菌可以从市场上购得。在上述培养基制备方法中，作为优选，步骤d所述的发酵时间为10 14小时，所述的发酵时间太短，则使合成的紫杉醇的反应不完全，影响到下一步合成反应，使产量降低，同时也浪费了原料；另一方面，如果发酵的时间过长，则使能耗增加，从而提高了生产成本；而利用本专利技术所述的培养基在欧文氏菌制备紫杉醇中，既提高了紫杉醇的产量，又达到了降低生产成本的目的。本专利技术的 另一个目的在于提供了一种本专利技术所述的培养基在欧文氏菌制备紫杉醇中的应用，所述的培养基在制备紫杉醇中的应用得到紫杉醇的产量为101.5yg/L 103.0 μ g/Lo具体的应用过程在于:将欧文氏菌按5%的接种量接种于上述步骤b所述的初始培养基中，同时，设定发酵温度为22°C，通气量为200L/h，转速为100r/min，发酵8 20小时后，加入步骤c中所述的苯丙氨酸，设定发酵温度为22°C，通气量为200L/h，转速为50r/min，发酵60小时，停止发酵，得到的含有紫杉醇的发酵液，产量为101.5μ g/L 103.0y g/L0所述的欧文氏菌是经过活化、一级种子培养、二级种子培养得到的欧文氏菌二级种子接种于上述培养基中，所述的活化是将欧文氏菌原种接种于活化培养基斜面，设定温度在30°C，进行活化培养48h后，将斜面活化两次，将活化两次后的菌种单菌落划线接种于上述的活化培养基平板上，设定温度在30°C，培养24h，划线平板上得到活化后的欧文氏菌种。所述的活化培养基包括以下成分及其质量浓度:Tryptone:20g/L ；Yeast Extract:5g/L ；NaCl:0.5g/L ；KC1:2.5mM ；MgCl2:本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，所述的培养基包括以下质量浓度的成分：大豆蛋白胨：１５～２５ｇ／Ｌ；工业酵母抽提物：４．５～５．５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ：０．１０～１．０ｇ／Ｌ；ＫＣｌ：０．０５～０．１５ｇ／Ｌ；葡萄糖：１～８ｇ／Ｌ；ＭｇＣｌ２：０．５～１．５ｇ／Ｌ；ＮａＡｃ：０．０５～０．１５ｇ／Ｌ；苯丙氨酸：２×１０－４～８×１０－４ｇ／Ｌ；ｐＨ：６．０～７．０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴翰桂，张昕欣，许玉丽，李娜，王玲萍，
申请(专利权)人：台州职业技术学院，
类型：发明
国别省市：33
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