本发明专利技术公开一种婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法，取婴幼儿配方奶粉试样，经水溶解后，用甲酸溶液调节pH至4.6，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸CMP、AMP、UMP、GMP、IMP经反相色谱柱分离，串联质谱，采用多反应离子监测（MRM）扫描模式，然后用基质加外标法进行定量。本发明专利技术LC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中五种核苷酸，在ESI方式下样品用量极少，不易污染离子源，灵敏度高，检测限低。特别是采用多反应离子监测（MRM）方法，可以很好地排除非核苷酸分子离子的干扰，同时样品预处理简单和适用范围广的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，特别涉及一种利用液相色谱-串联质谱、多反应离子监测测定婴幼儿配方奶粉中胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸五种核苷酸的检测方法，属于化学成分检测的
技术介绍
核苷酸是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接而成。碱基与糖通过糖苷键连成核苷，核苷与磷酸以酯键连成核苷酸。其主要生理功能是广泛参与人体的能量代谢、蛋白质合成，具有提高各种酶的活性、活化细胞功能、促进抗体形成、增强免疫功能的作用。它们可促进神经细胞的生长发育，是与“神经生长因子”有关或者可以作为神经生长物质利用的营养成分。一些临床上的研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。目前婴幼儿配方奶粉中添加的核苷酸主要有5种胞嘧啶核苷酸(cytidine，CMP)；尿嘧啶核苷酸(uridine，UMP)；腺嘌呤核苷酸(adenosine， AMP)；鸟嘌呤核苷酸(guanosine，GMP)；次黄嘌呤核苷酸(inosine，IMP)。牛奶中一般不含有核苷酸，但由于核苷酸对婴幼儿的特殊功效，许多奶制品企业都把核苷酸作为重要添加剂。但人体对核苷酸的需求有一定的限度，并非越多越好。为此对婴儿奶粉产品中核苷酸的质量监控极为重要，必须尽快研究制定适用于乳制品的检测方法 。目前报道的检测方法主要有高效毛细管电泳法& 4]、反相高效液相色谱法& 6]、离子交换色谱法等。毛细管电泳法受到进样量小、检测池光程短等限制，存在定量重现性差、灵敏度低等不足。液相色谱法则柱效偏低，在分离复杂基质样品时，杂质不能与AMP等分离。 在离子交换色谱分离五种核苷酸时，由于婴幼儿配方乳粉中还存在大量其它寡核苷酸而极易受到干扰。总之现有方法都存在较大的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以快速、直接地给出待测样品各核苷酸组分的相对分子质量和特征离子的液相色谱-串联质谱、多反应离子监测的核苷酸含量快速测定新方法。本专利技术的目的是这样实现的，所述的， 具体步骤为试样经水溶解后，用甲酸溶液调节PH至4. 6，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、 过滤，滤液中的五种核苷酸经反相色谱柱分离，串联质谱，采用多反应离子监测(MRM)扫描模式，然后用基质加标外标法进行定量。所述的色谱柱为Symmetry C18 (2. I^X 150讓、粒径3. 5 μ m)柱；柱温40°C ；样品温度25°C;进样量10 μ L ；流速0. 3 mL/min ；流动相A :0. 1%甲酸水溶液，流动相B 乙腈，以线性梯度洗脱；质谱条件是离子源ESr;毛细管电压3.00 kV;锥孔电压40 V;离子源温度 1200C ；RF透镜1 :30. 0 ；光圈0. 4 ；RF透镜2 :0. 6 ；锥孔反吹气流量50 L/h ；脱溶剂气温度:3500C ；脱溶剂气流量:500 L/h ；碰撞池压力(mbar) :2. 5X10-3。本专利技术的检测方法的主要技术特点ESI是一种非常软的电离方式，可以很方便地用于强极性、难挥发性化合物的离子化， 是用质谱进行大分子化合物相对分子质量测定的一个重大突破。ESI电离方式的出现使这一问题迎刃而解。同时利用LC-MS/MS多反应离子监测(MRM)方式检测可以快速、直接地给出待测样品各核苷酸组分的相对分子质量和特征离子的质量，从而提高定性的能力；利用基质加标外标法定量，提高了检测限，减少了干扰、使检测结果更加精确。1.电喷雾离子源离子化及多反应离子监测(MRM)方式检测；基质加标外标法定量；同时提高了检测限，减少了干扰、使检测结果更加精确；2. 前处理只是简单的调pH 值，超声提取，提高检验速度，降低劳动率。3. 利用反相色谱原理，实现五种核苷酸的分1 O本专利技术采用LC-MS/MS多反应离子监测(MRM)方式检测，可以快速、直接地给出待测样品各核苷酸组分的相对分子质量和特征离子的质量，从而提高定性的能力。选用基质加标外标法定量，试样经水溶解后，用甲酸溶液调节pH至4. 6，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸经反相色谱柱分离，比其它检测方法简单的多。另外，ESI方式下样品用量极少，不易污染离子源，灵敏度高，检测限低。特别是采用多反应离子监测(MRM)方法，可以很好地排除非核苷酸分子离子的干扰，使图谱的解析变得简单而直观。本专利技术优点为本专利技术采用Symmetry C18 (2.1 mmX150 mm、3. 5 μ m)色谱柱分离，流动相A相为0. 1%甲酸的水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱；串联质谱检测。五种核苷酸 CMP、AMP、UMP、GMP、IMP 的最低检出限(LOD)分别为 0. 50,0. 20、1. 20,0. 30,0. 60 μ g/kg, 最低定量限(LOQ)分别为 2. 00、1. 00,4. 00、1. 00,2. 00 μ g/kg。相关系数 r > 0. 999，回收率在90.0% 110.0%之间。本专利技术LC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中五种核苷酸，在 ESI方式下样品用量极少，不易污染离子源，灵敏度高，检测限低。特别是采用多反应离子监测(MRM)方法，可以很好地排除非核苷酸分子离子的干扰，同时样品预处理简单和适用范围广的优点。附图说明图1为五种核苷酸的总离子流色谱质谱图。图2为五种核苷酸的特征离子色谱-质谱图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明 1.实验部分1. 1试剂CMP，纯度彡98%，UMP，纯度彡99%，AMP，纯度彡99. 0%，GMP，纯度彡99%, IMP,纯度彡99% 均为分析纯(SIGMA公司)。甲酸、甲酸铵、乙酸、氨水、乙酸铵为优级纯。实验用水均为18.2MΩ 'cm的超纯水。设备 液相色谱串联四极杆质谱联用仪(Agilentl200RRLC、Agilent6410BQQQ、Masshanter 软件)；MiIli-Q水纯化系统(Millipore公司)；旋涡混合器；超声波清洗器；高速离心机； PHS-3E型实验室pH计。标准溶液配制精密称取CMP、AMP、UMP、GMP、IMP，超纯水配成1 mg/mL标准储备液。避光，低温保存。空白基质溶液制备取未强化核苷酸的婴幼儿配方乳粉1. 00 g，用PH 4.6甲酸水溶液定容至100 mL。超声波震荡10 min，在4°C下离心15 min(转速15000 rpm)，吸取上清液，用0.22 μ m微孔滤膜的一次性滤头过滤。弃去前0.5 mL滤液后接取滤液，备测。样品预处理称样品1. 00 g，用PH 4. 6甲酸水溶液定容至100 mL，超声波震荡10 min，在4°C下离心15 min (转速15000 rpm)，吸取上清液，用0.22 μ m微孔滤膜的一次性滤头过滤。弃去前0.5 mL滤液后接取滤液，备测。仪器条件1.6. 1液相色谱条件色谱柱Symmetry C18 (2. 1匪X 150匪、粒径3. 5 μ m)柱；柱温40°C;样品温度25°C; 进样量10 μ L ；流速0. 3 mL/min。流动相A :0. 1%甲酸水溶液，B 乙腈。线性梯度洗脱条件参见表1。表1高效液相色谱串联质谱分离梯度洗脱条件_本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法，其特征在于：婴幼儿配方奶粉试样经水溶解后，用甲酸溶液调节ｐＨ至４．６，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸ＣＭＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ经反相色谱柱分离，串联质谱，采用多反应离子监测（ＭＲＭ）扫描模式，然后用基质加外标法进行定量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈光耀，林玉宙，
申请(专利权)人：明一福建婴幼儿营养品有限公司，
类型：发明
国别省市：35
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