本发明专利技术涉及基因工程领域，特别涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体，所述多基因双元表达载体通过多克隆酶切位点，将单个基因或多个基因连成多基因聚合体形成同源重组中间载体，然后通过同源重组将单个基因或多基因聚合体加进基本双元载体中，所述同源重组可以多次进行，使基本双元载体的T-DNA的长度逐步加大，构成含有多基因的双元表达载体；本发明专利技术还公开了多基因双元表达载体的构建方法以及在植物转基因中的应用，本发明专利技术公开的多基因双元表达载体用于植物遗传改造中，能够同时转入多个靶基因，具有共转化效率高的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体，还涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法及其应用。
技术介绍
众多基因的功能明确后，需要将大量基因聚合导入到栽培作物，以对其综合农艺性状或多种性状实施改良。因此基因大规模的遗传转化或大片段DNA的遗传转化，是植物转基因研究与利用的重要发展方向之一。目前，实现多基因转化植物主要通过多基因聚合法，包括多个表达载体多次转化法、多个表达载体共转化法、多基因单载体的一次性转化法。多个表达载体多次转化法是将一次转化的植株作为受体接受二次转化，顺序多重转化将外源基因反复多次地导入同一生物中以达到目标基因的聚合；这种方法虽然不用考虑载体的容量，但是由于转化是进行多次独立转化，其工作量大、转基因植株的稳定性差、 获得含有多个靶基因的转基因纯合系比较困难。多个表达载体共转化法是将位于不同载体上的多个基因同时转化到同一植物中，是一步法多基因转化，这种方法降低了工作量，但是实现多基因同时转化的共转化效率低。多基因单载体的一次性转化法分为多个基因融合克隆到表达载体的一个表达盒上或将多个靶基因串联在一个载体上；这种方法避免了费时费力和共转化频率低，但是，由于在构建多基因单载体大都采用酶切连接的方法，加上的目的基因受酶切位点的限制，使研究者不能按需要连入多个基因，制约了多基因载体的构建。因此，急需一种多基因双元表达载体，能够同时转入多个基因而连入的多个基因不受酶切位点的限制，具有共转化效率高的优点。同源重组是低等生物中普遍存在的DNA 重组方式。它不依赖于限制性酶酶切位点，可使两个DNA分子之间的遗传信息精确和特异性交换。利用同源重组途径，是植物基因工程研究早期建立的构建共整合Ti载体的一种方法。但是利用多重同源重组途径、逐步将基因添加进双元表达载体的T-DNA中，构建多基因双元表达载体的方法，目前尚未见报道。
技术实现思路
有鉴于此，为了解决上述问题，本专利技术的目的之一在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体；本专利技术的目的之二在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体的构建方法，本专利技术的目的之三在于提供多基因双元表达载体在植物转基因中的应用，从而为实现多基因遗传转化提供有力工具，实现对植物多种性状实施改良。本专利技术目的之一在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体，所述多基因双元表达载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、大肠杆菌复制子Cb^V、原核抗性标记基因Kan，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因ζ^ //、原核抗性标记基因、至少两个靶基因和右边界顺序串联；所述多基因双元表达载体由基本双元载体和同源重组中间载体构成，所述基本双元载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、大肠杆菌复制子Cb^Y、原核抗性标记基因◎/ ，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因/7/7 //、至少一个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括T-DNA区、原核抗性标记基因和大肠杆菌复制子Cb^Y，所述T-DNA区包括左边界、原核抗性标记基因、至少一个靶基因；所述同源重组中间载体与所述基本双元载体的所述左边界、所述原核抗性标记基因& 和所述大肠杆菌复制子Cb^Y顺序串联构成同源重组片段；所述同源重组中间载体靠近所述大肠杆菌复制子Cb^Y的所述靶基因与所述基本双元载体所述T-DNA区靠近左边界一侧的所述靶基因有1. 3-2. 2 1Λ的序列相同构成同源重组片段，所述同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。进一步，所述多基因双元表达载体所述T-DNA区由左边界，真核抗性标记基因 /τ/ //，原核抗性标记基因 rXetk, PsSym35、PsSynmlO、PsENOD 12a MPsLectin 四个靶基因和右边界顺序串联；所述基本双元载体所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因/^i//部分ffHPsSy膽10、PsLectin私PsENOD 12a三个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括基于Amp筛选同源重组中间载体或基于Tc筛选同源重组中间载体，所述基于Amp筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区由所述左边界、原核抗性标记基因基因， PsSym35和PsSynmlO'靶基因顺序串联；所述基于Tc筛选同源重组中间载体的所述T-DNA 区的由所述左边界、真核抗性标记基因fl/7i//、原核抗性标记基因TetA基因、靶基因顺序串联。本专利技术目的之二在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，包括以下步骤a.基于Amp筛选同源重组中间载体采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子PVSl-REP和右边界序列，在所述T-DNA区插入至少一个靶基因和基因，得基于Amp筛选同源重组中间载体；b.基于Tc筛选同源重组中间载体采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVSl-REP和右边界序列，在所述基本双元载体所述T-DNA区插入TetA基因和至少一个靶基因，得基于Tc筛选同源重组中间载体；c.构建多基因双元表达载体将基本双元载体转化所述根癌农杆菌，得含有基本双元载体的根癌农杆菌，将步骤a 所得的基于Amp筛选同源重组中间载体转化进所得含有基本双元载体的根癌农杆菌中，所述同源重组片段发生同源重组，得含重组DNA分子的根癌农杆菌；将步骤b所得的基于Tc 筛选同源重组中间载体转化所得含重组DNA分子的根癌农杆菌，所得重组DNA分子即为多基因双元表达载体。进一步，所述基本双元载体按如下步骤制得(1)克隆豌豆品种食荚大菜豌AZecii/ 基因，连接PMD18-T载体，得PVCT1215载体； 克隆豌豆品种食荚大菜豌/ ^ ^^ 基因，连接PMD18-T载体，得pVCT12^载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT1227载体；(2)克隆pBIN19载体Pnos:基因，进行酶切，同时酶切pCAMBIA1302载体，将Pnos: :/ /7 //基因与pCAMBIA1302载体酶切片段连接，得pVCT2020载体；(3)酶切所得PVCT1215载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收；同时酶切所得pVCT2020 载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；将PVCT1215载体与pVCT2020载体的回收片段连接，得 PVCT2105 载体；(4)酶切所得pVCT2105载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切所得pVCT12^5 载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，将PVCT2105载体与pVCT12^5载体的回收片段连接， 得PVCT2120载体；(5)酶切所得pVCT1227载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT1227酶切片段； 同时酶切PVCT2120载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT2120酶切片段；将回收的 PVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片进行连接，得基本双元载体pVCT2121。进一步，步骤a所述基于Amp筛选同源重组中间载体按如下步骤制得al酶切所得基本双元载体PVCT2121载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，补平后连接，得 PVCT1210 载体；a2酶切步骤al所得pVCT1210载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1210酶切片段， 所述PV本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．利用同源重组构建多基因双元表达载体，其特征在于：所述多基因双元表达载体包括Ｔ－ＤＮＡ区、农杆菌复制子ｐＶＳ１－ＲＥＰ、大肠杆菌复制子ＣｏｌＥ１、原核抗性标记基因Ｋａｎ，所述Ｔ－ＤＮＡ区由左边界、真核抗性标记基因ｎｐｔＩＩ、原核抗性标记基因、至少两个靶基因和右边界顺序串联；所述多基因双元表达载体由基本双元载体和同源重组中间载体构成，所述基本双元载体包括Ｔ－ＤＮＡ区、农杆菌复制子ｐＶＳ１－ＲＥＰ、大肠杆菌复制子ＣｏｌＥ１、原核抗性标记基因Ｋａｎ，所述Ｔ－ＤＮＡ区由左边界、真核抗性标记基因ｎｐｔＩＩ、至少一个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括Ｔ－ＤＮＡ区、原核抗性标记基因Ｋａｎ和大肠杆菌复制子ＣｏｌＥ１，所述Ｔ－ＤＮＡ区包括左边界、原核抗性标记基因、至少一个靶基因；所述同源重组中间载体与所述基本双元载体的所述左边界、所述原核抗性标记基因Ｋａｎ和所述大肠杆菌复制子ＣｏｌＥ１顺序串联构成同源重组片段；所述同源重组中间载体靠近所述大肠杆菌复制子ＣｏｌＥ１的所述靶基因与所述基本双元载体所述Ｔ－ＤＮＡ区靠近左边界一侧的所述靶基因有１．３－２．２ｋｂ的序列相同构成同源重组片段，所述同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张兴国，苏承刚，杜小兵，钱春，陈友龙，谢玉会，万发香，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：85
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。