一种氨苄青霉素抗性质粒载体及其制备与应用制造技术

技术编号:7083802 阅读:973 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术公开了一种氨苄青霉素抗性质粒载体及其制备与应用。本发明专利技术的氨苄青霉素抗性质粒载体的质粒骨架上含有抗氨苄青霉素基因,所述抗氨苄青霉素基因为β-内酰胺酶的编码基因与β-半乳糖苷酶α肽编码基因的融合基因。本发明专利技术的氨苄青霉素抗性质粒载体可用于构建重组载体。相比未改造的氨苄青霉素抗性质粒载体,转化有本发明专利技术的氨苄青霉素抗性质粒的菌株在培养过程中β-内酰胺酶泄漏显著减少,从而避免了β-内酰胺酶泄漏对于转化菌培养所造成的不利影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和微生物学领域。具体地讲,本专利技术涉及一种β-内酰胺酶泄漏减少的氨苄青霉素抗性质粒载体及其制备与应用
技术介绍
1973年,美国科学家专利技术了重组DNA技术,标志着人类认识生命本质并能按照自己意愿改造生命的新时期开始。在这之后的三十多年里,以重组DNA技术为基础的基因工程得到了蓬勃发展。基因工程技术通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”,实现基因改造和重新组合,然后导入宿主细胞进行无性繁殖,并诱导重组基因的表达,产生出所需要的基因产物。基因工程技术不仅在基础研究中有着广泛的应用,也在数以千亿美元计的生物技术产业中发挥着重要作用。载体是用来协助将目的基因引入宿主细胞进行增殖或表达的DNA片段。基因工程中常用的载体主要包括质粒、噬菌体和病毒三大类,其中以质粒的使用最为广泛。质粒是独立于细胞染色体外具有自我复制能力的双链环状DNA。最早使用的质粒载体是PBR322, 它是一人工构建的DNA片段,分子大小为4. 3kb,带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因以利于筛选的标志基因,并含有EcoRI、BamHLHindIII等单一的限制酶切点以方便目的基因的克隆。现今使用的质粒大多来自pBR322的改造,它们的一个共同特点是使用抗氨苄青霉素基因作为筛选标志。氨苄青霉素是现今使用最广泛的抗生素,它的抑菌机理是使细菌细胞膜的内层转肽酶失活从而抑制细胞壁的合成,细菌因无法合成完整的细胞壁而导致无法生长。抗氨苄青霉素基因(bla)编码β -内酰胺酶(β-lactamase),β -内酰胺酶在胞质内合成后经自身信号肽引导进入周质空间(细胞内、外膜之间一狭窄区域)。跨膜后,信号肽被信号肽酶切除,产生成熟的β "内酰胺酶。β "内酰胺酶水解氨苄青霉素的β "内酰胺环使其失效,转化菌因而也得以在氨苄青霉素存在的环境下生长。可以看出,β -内酰胺酶分泌至周质空间是转化菌产生氨苄青霉素抗性的先决条件。有研究表明,大肠杆菌外膜蛋白的信号肽引导内酰胺酶至周质空间的效率相比内酰胺酶的自身信号肽要高出 100倍以上。然而,因为尚未知的原因,分泌至周质空间的β -内酰胺酶可进一步泄漏至胞外, 将胞外环境中的氨苄青霉素破坏掉。当转化菌在琼脂固体培养基上培养时,泄漏至胞外的内酰胺酶在转化菌周围形成一个无氨苄青霉素选择压力的区域,在那个区域非转化菌也能够生长,形成大家所熟知的“卫星菌落”,这会干扰对转化菌的挑选。当转化菌被应用于液体培养基中培养时,内酰胺酶的泄漏会造成更严重的问题。由于内酰胺酶的迅速扩散,液体培养基中的氨苄青霉素会被全部破坏掉,使得整个环境的选择压力消失。转化菌细胞中的质粒存在分离不稳定性,质粒在细胞分裂过程中不是平均分配,在细胞分裂时会产生不含有质粒的细胞。在选择压力消失的环境中,不含有质粒的细胞会迅速生长。因为不含有质粒的细胞代谢负担比含有质粒的细胞要轻,不含有质粒的细胞生长速度比含有质粒的细胞要快。由于存在竞争优势,培养物最终将被不含有质粒的细胞所主导,含有质粒的细胞在培养物中只占很小的比例,这对相关的应用如质粒的抽提、蛋白质的表达等会造成严重的负面影响。培养基中氨苄青霉素的选择压力也会因为受培养基酸化影响而被破坏。随着培养时间的延长,细菌的代谢活动促使培养基的PH降低,而氨苄青霉素在酸性环境下易发生水解,这个问题可以通过调控培养基的PH或者采用羧苄青霉素来避免,因为羧苄青霉素在酸性环境中的稳定性相比氨苄青霉素要高很多。但是,羧苄青霉素的价格是是氨苄青霉素的数倍;而且,跟氨苄青霉素一样,羧苄青霉素不能抵抗β -内酰胺酶的水解作用。因此,减少甚至消除内酰胺酶的泄漏对于保持培养环境中的选择压力是至关重要的。对于以重组蛋白质表达为目的的培养而言,保持培养环境的选择压力非常重要。 如果选择压力消失,导致最终培养物中无质粒的细胞占主导,则由于目的基因的丢失,目标蛋白质的表达水平将很低。一些方法已经被报道用来减少内酰胺酶泄漏造成的负面影响,包括在培养物中加入β “内酰胺酶的抑制剂甲氧苯青霉素;洗涤细胞以去除β “内酰胺酶;使用高度稀释的培养物用于接种等。但是,这些方法并不解决内酰胺酶的泄漏问题,只是β-内酰胺酶的泄漏后的补救措施。因为每批次的培养都需要进行这些操作,这些方法费事、也不经济。同时,由于内酰胺酶的不断合成和泄漏,这些方法的效果是有限的。
技术实现思路

技术介绍
中所述,为了减少培养过程中内酰胺酶泄漏造成的不利影响,已经提出了一些方法。但这些方法要求在每批次培养中都进行相关操作,既费事、又不经济。 本专利技术的目的在于克服现有技术中的局限性,将减少内酰胺酶泄漏作为目标,而不是去想办法补救内酰胺酶泄漏造成的负面影响。在此基础上,提供一种减少携带有氨苄青霉素抗性质粒的大肠杆菌在培养过程中内酰胺酶泄漏的方法及其应用。本专利技术主要通过对现有质粒载体质粒骨架上氨苄青霉素抗性基因的改造,来解决 β-内酰胺酶泄漏的问题。为了实现上述目的,本专利技术首先公开了一种氨苄青霉素抗性质粒载体,所述氨苄青霉素抗性质粒载体的质粒骨架上含有抗氨苄青霉素基因,所述抗氨苄青霉素基因为 β-内酰胺酶的编码基因(bla)与β-半乳糖苷酶α肽编码基因(IacZa)的融合基因。所述融合基因中,β-半乳糖苷酶α肽编码基因连接于β -内酰胺酶编码基因的 3’端。半乳糖苷酶α肽编码基因与内酰胺酶编码基因直接相连,或者两者之间经连接肽编码基因连接,连接肽编码基因编码的连接肽应不影响融合蛋白功能。常用的不影响融合蛋白功能的连接肽序列可以是=GlyGlySer, (GlyGlySer)2, (GlyGlySer)3, (GlyGlySer)4, SerProGlySer, GlySerGlySerGly, (GlySerGlySerGly)2, (GlySerGlySerGly)3 GlyGlySerGlyGly, (GlyGlySerGlyGly)2, (GlyGlySerGlyGly)3 GlyGlyGlyGlySer, (GlyGlyGlyGlySer)2, (GlyGlyGlyGlySer)3, (His)6, (His)8, GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly 或 GlySerAlaGlySerAlaAlaGlySerGlyGluPhe。本专利技术的氨苄青霉素抗性质粒载体质粒骨架上的其他构架均为常规。进一步的,所述融合基因编码序列为SEQ ID NO 14的融合蛋白,或者所述融合基因编码的蛋白质其氨基酸序列与SEQ ID NO :14具有高度同源性。进一步的,所述融合基因的序列为SEQ ID NO :1,或者所述融合基因的序列与SEQ ID NO :1具有高度同源性。本专利技术的氨苄青霉素抗性质粒载体可用将现有氨苄青霉素抗性质粒载体中的 β-内酰胺酶编码基因采用所述融合基因替换的方法获得。所述现有氨苄青霉素抗性质粒载体可以是任一具有氨苄青霉素抗性并以β _内酰胺酶编码基因作为其抗氨苄青霉素基因的载体。现有氨苄青霉素抗性质粒载体可以是如 PET系统、pMAL系统、pTrc系统或pGEX系统中的载体。本专利技术的氨苄青霉素抗性质粒载体可用于构建重组载体。转化有本专利技术的氨苄青霉素抗性质粒的菌株,相比转化有未改造的氨苄青霉素抗性质粒载体的菌株,转化本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种氨苄青霉素抗性质粒载体,所述氨苄青霉素抗性质粒载体的质粒骨架上含有抗氨苄青霉素基因,所述抗氨苄青霉素基因为β-内酰胺酶的编码基因与β-半乳糖苷酶α肽编码基因的融合基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:傅向阳李威
申请(专利权)人:生工生物工程上海有限公司
类型:发明
国别省市:31

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