本发明专利技术公开了一种siRNA输送载体，所述输送载体的活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。另外，本发明专利技术还公开了一种真核细胞转染液，包含由siRNA和所述siRNA输送载体组成的复合物。本发明专利技术的siRNA输送载体具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，是一个安全、高效、具有siRNA输送功能的纳米载体，在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种SiRNA输送载体及其在制备癌症的基因治疗药物中的应用。
技术介绍
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发现的在生物界普遍存在的一种古老的生物学现象，是生物进化的产物。具体是指由双链RNA (double strand RNA, dsRNA)指导的，在特定酶参与下，以外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象，即不表达。目前研究表明，RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现。RNAi不仅参与了细胞正常的生长、发育、衰老和凋亡的调控，还可使外源基因导入时或病毒入侵后基因不被表达，从而成为生物体的一种有效的特异性自我防御机制。RNA干扰能特异而有效的阻断靶基因的表达外源性或内源性dsRNA，在细胞内导致与其序列同源的分子发生特异性降解，从而干扰相应基因的表达。dsRNA引起RNA干扰的过程为核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的siRNA，大小约21-2;3bp。siRNA具有一些特征性结构即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5'端磷酸和3'端羟基。此外，每条单链的3'端均有2-3个突出的非配对的碱基，这种结构形式对siRNA进入蛋白复合体是必须的。siRNA是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义链再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。携带反义链的的 RISC 与 mRNA 的互补序列特异性结合并切割mRNA。被切割后断裂的mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞内特定 mRNA的降解反应。RNAi具有普遍、高效、特异、操作简单等突出优点，目前该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。胃癌的发生是一个多步骤多阶段的过程，其特征是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。还有凋亡相关基因的异常表达、部分自分泌生长因子和受体的过量表达也与细胞癌变有密切关系。研究发现，多个分子标志物与胃癌转移潜能相关，其中研究较为深入的包括CD44异构体6 (CD44 variant isoform 6，CD44v6)。CD44由一个包含20个外显子的基因编码，其中10个外显子是组成型外显子，另外10个外显子可选择性拼接而被称为变异外显子(variant exon, vl-vl0)。仅含有组成型外显子称为CD44标准体(CD44 standard form，CD44s)，而含有变异外显子则为 CD44 异构体(CD44 variant isoform，CD44v)。CD44s 广泛存在于在正常组织和癌组织中，而CD44v主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中。CD44v胞内区域与下游因子的选择性相互作用在协调细胞内信号通路起着重要作用，如Mio/Ras、酪氨酸激酶途径等，并与肿瘤细胞生长、迁移和侵袭作用密切相关。CD44v6是目前研究较为广泛的异构体，被认为是上皮起源恶性肿瘤，包括肝细胞癌，乳腺癌，结直肠癌和胃癌发生转移的分子标志物，尤其是胃癌发生转移相对特异的分子标志物，制备抗CD44v6单链抗体用于进展期胃癌的生物治疗，可以封闭性结合胃癌组织表达的3CD44v6,阻断其与细胞外间质或基底膜的正常连接及其所促进的肿瘤细胞浸润转移，延缓肿瘤进展；破坏CD44v6蛋白在肿瘤细胞表面形成的糖蛋白伪装，有利于免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀灭，抑制肿瘤的淋巴转移。采用RNAi技术可特异地抑制相关基因的表达，使这些基因呈现沉默或休眠状态.从而达到肿瘤治疗的目的。与传统的基因治疗的方法相比，RNAi能够实现同一基因家族的多个基因同时敲除，且抑制效果互不干扰，因为其特有的优势成为基因治疗的新策略。siRNA给药载体的研究和开发一直是困扰各国科学家的关键问题。人们一直在研究合适的载体材料能有效地将siRNA药物分子输送到靶细胞和部位，并在一段合理时间维持其功效。目前所采用的载体体系大多是阳离子脂质体或水溶性的阳离子聚合物，将这些载体分子与siRNA溶液互混得到二者的复合物，从而实现传递siRNA的目的，这类方法的不足就是不容易放大规模并且重复性较差。另外，基于高分子的纳米颗粒已经广泛用于从小分子到生物活性DNA分子的传递的研究，取得了不菲成绩，其中很多成果已经用于临床或临床试验。高分子纳米颗粒的传递体系生物相容性好，具有靶向传递的潜能，具有更好的稳定性，能有效保护生物活性分子对生理环境的耐受性，并增强细胞对被传递分子的吸收。特别值得指出的是高分子自组装的纳米粒具有EI3R效应(Enhanced permeability and retention)，可促进药物在肿瘤组织的富集，并能有效地被肿瘤部位细胞吸收，进入细胞质和各种细胞器，因此高分子纳米粒是极具潜能的siRNA传递系统的候选者。而具有良好生物相容性的可降解高分子载体，特别是具有快速去质子化能力的可降解阳离子型高分子载体能有效结合和保护siRNA分子，又能使siRNA在细胞质中迅速释放，实现阻断基因表达的目的，这将使这类载体在siRNA给药中具有更好的优势和应用前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的所解决的技术问题在于提供一种siRNA输送载体，具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，是一个安全、高效、具有siRNA输送功能的纳米载体。一方面，本专利技术提供了一种siRNA输送载体，其活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。优选地，所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺为单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通过配体交换包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子。其中，超顺磁性氧化铁纳米粒子控制在40_60kD之间，优选控制在50_60kD之间， 最优为55KD ；聚乙二醇-聚乙烯亚胺控制在40-60kD之间，优选控制在40_50kD之间，更优控制在42-48kD之间，最优为45KD。例如在本专利技术的实施例1中，即是选择2kD的单甲基醚聚乙二醇与25kD枝化聚乙烯亚胺以10 1的摩尔比合成聚乙二醇-聚乙烯亚胺；而后再与55kD的超顺磁性氧化铁纳米粒子以偶联形成的本专利技术的siRNA输送载体，通过对胶粒理化性质的测试，超顺磁性氧化铁纳米粒子占胶粒质量的55%。而且结合本专利技术实施例中的实验结果表明，采用上述分子量范围内或者本专利技术实施例中所用的成分，能够使本专利技术的 siRNA载体与待输送的siRNA有效结合，提高siRNA的输送效率，对RNA干扰效果有积极的影响。优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为60_80nm，表面zeta电位为30_40mV。本专利技术实施例中纳米颗粒的平均粒径优选为67. 3士2. Onm，表面zeta电位优选为34. 38士 1. 66mV。从分子结构上分析，本专利技术提供的siRNA输送载体含有由超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。其中，聚乙烯亚胺(polyethyleneimi本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ｓｉＲＮＡ输送载体，其中，所述输送载体的活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇－聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄开红，陈茵婷，
申请(专利权)人：黄开红，陈茵婷，
类型：发明
国别省市：81
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