长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基，其特征在于分离期胚盘明区的细胞，经机械吹打分散成单个细胞或小细胞团后，接种于STO饲养层，用上述鸡胚胎干细胞在专用培养基及37~38℃环境下培养，3~5天传代一次，专用培养基包括条件培养液600-900mL；胎牛血清50-150mL；鸡血清5-20mL；非必需氨基酸中的一种或几种混合物5-25mL；L-谷氨酰胺0.146-0.292g；β-巯基乙醇6-14μL；小鼠白血病抑制因子1—2×106IU；碱性成纤维细胞生长因子10-50μg；干细胞生长因子5-20μg，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000mL，调pH值为7.2-7.5，条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。本发明专利技术与已有技术相比，具有可以实现鸡胚胎干细胞的长期传代培养，并具有细胞增殖快、克隆获得率高的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种动物细胞工程领域，特别市一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基。
技术介绍
胚胎干细胞是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的一种具有发育全能性的高度未分化细胞，可分化形成动物机体的绝大多数终端细胞以及具有生殖系传递能力，因此在组织器官工程、细胞治疗以及动物遗传修饰与操作等方面具有广阔的应用前景。胚胎干细胞具有自发分化的趋势，培养胚胎干细胞的关键技术是需要筛选合适的培养体系使细胞既能快速无限增殖又能保持未分化状态。常用方法包括(1)采用饲养层， 饲养层细胞通过某种尚不完全清楚的机理抑制胚胎干细胞的分化；(2)条件培养基条件培养基中含有抑制细胞分子的因子；(3)采用抑制细胞分化或促进细胞增殖的细胞因子， 包括白血病抑制因子，干细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等等。自1981年Evans 等从延迟着床的小鼠早期胚胎成功建立胚胎干细胞系以来，基于上述一种或多种方法的联合运用，目前已在人、猪、牛、绵羊、山羊、水貂、恒河猴、马以及兔等物种实现了胚胎干细胞的长期传代培养并成功建立胚胎干细胞系或类胚胎干细胞系。但迄今为止，尽管有培养鸡胚胎干细胞的报道，但均只能在很短的时间内维持其未分化状态，尚未能实现鸡胚胎干细胞在体外的长期传代培养及建立细胞系。鸡胚胎干细胞不能在体外长期传代培养的一个重要原因是，目前的胚胎干细胞培养体系，包括培养基配方，均是基于鼠或人等哺乳动物而设计，而禽类细胞与哺乳动物细胞存在较大差异，一些适用于哺乳动物胚胎干细胞的培养条件或培养基配方，可能并不能完全满足鸡胚胎干细胞离体培养的需要。因此，这些培养条件或培养基配方，尽管能够在一段时间内使鸡胚胎干细胞维持未分化状态，但长期传代培养时将不能维持这种状态而导致细胞迅速分化。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种适用于鸡胚胎干细胞的培养体系，以实现鸡胚胎干细胞在体外的长期传代培养的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基。本专利技术的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法是这样实现的，分离X期胚盘明区的细胞，经机械吹打分散成单个细胞或小细胞团后，接种于STO饲养层，用上述鸡胚胎干细胞在专用培养基及37 38°C环境下培养，3飞天传代一次，专用培养基包括差件培养液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；鸡血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一种或几种混合物5 — 25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巯基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；碱性成纤维细胞生长因子10 — 50 μ g ；干细胞生长因子5 — 20 μ g，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000 mL，调pH值为7. 2—7. 5，条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后(通常为3天)，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。这里，滤膜是0. 22um微孔得滤膜，离心分离的转速为lOOOrpm，离心分离时间不少于5min。本专利技术的专用培养基包括条件培养液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；鸡血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一种或几种混合物5—25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巯基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；碱性成纤维细胞生长因子 10—50 μ g ；干细胞生长因子5 — 20 μ g，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000 mL, 调PH值为7. 2—7. 5,条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后(通常为3 天)，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。这里，滤膜是 0. 22um微孔得滤膜，离心分离的转速为lOOOrpm，离心分离时间不少于5min。本专利技术与已有技术相比，具有可以实现鸡胚胎干细胞的长期传代培养，并具有细胞增殖快、克隆获得率高的优点。附图说明图1 (A)为在本专利技术所述培养体系中培养的传至第2代的鸡胚胎干细胞； 图1 (B)为在本专利技术所述培养体系中培养的传至第5代的鸡胚胎干细胞；图1 (C)为在本专利技术所述培养体系中培养的传至第10代的鸡胚胎干细胞；图1 (D)为在本专利技术所述培养体系中培养的传至第15代的鸡胚胎干细胞；图1 (E)为在本专利技术所述培养体系中培养的传至第19代的鸡胚胎干细胞；图1 (F)为在本专利技术所述培养体系中培养的传至第25代的鸡胚胎干细胞图2(A)为碱性磷酸酶染色呈蓝紫色的鸡胚胎干细胞的鉴定；图2(B)为免疫细胞荧光鉴定SSEA-I呈阳性的鸡胚胎干细胞的鉴定；图2(C)为分化培养基中悬浮培养形成拟胚体并高度表达中胚层的鸡胚胎干细胞的鉴定；图2(D)为内胚层以及外胚层的标志基因CH-T的鸡胚胎干细胞的鉴定； 图2(E)为内胚层以及外胚层的标志基因TTR的鸡胚胎干细胞的鉴定； 图2(F)为内胚层以及外胚层的标志基因β-activin的鸡胚胎干细胞的鉴定； 图3为RT-PCR检测拟胚体中三个胚层特异性基因的引物序列。具体实施例方式现结合实施例对本专利技术做进一步详细描述 (一)试验动物及细胞系受精种鸡蛋购自广东省食品企业集团佛山市南海种禽有限公司；清洁级怀孕12. 5 d 昆明小白鼠购自南方医科大学实验动物中心；STO细胞系购自武汉大学保藏中心(中国典型培养物保藏中心)；大鼠肝细胞系(buffalo rat liver cell，BRL-3A细胞)购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。(二)溶液或试剂配制1. PBS 的配制称取 NaCl 8. Og^Na2HPO4 3. 63g、KCl 0. 2g KH2PO4 0. 24g 溶于适量超纯水，调PH值至7. 4，定容至IOOOmL ； IOOrnl/瓶分装，15磅高压灭菌30min，4°C保存备用。2. DMEM的配制取DMEM —包(葡萄糖含量13. 5克，Gibco公司)用适量超纯水溶解，称取NaHCO3 3. 7g，溶于超纯水中混勻，加青链霉素I mL (10万IU/mL)，用超纯水定溶至1000 mL，调pH 7. 2左右，0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，100 mL分装，4°C保存备用。3. Hanks液的配制取Hanks —包(Gibco公司)用适量超纯水溶解，称取NaHCO3 0. 35g，溶于超纯水中混勻，加青链霉素1 mL (10万IU/mL)，用超纯水定溶至1000 mL，调pH 7. 2左右，0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，100 mL分装，4°C保存备用。4.胰蛋白酶的配制称取胰蛋白酶0. 25g溶于100 mL PBS，0. 22μπι微孔滤膜过滤除菌，1 mL分装，4°C保存备用。5.干细胞生长因子的分装取一个包装的干细胞生长因子(Invitrogen公司)溶于100 μ L超纯水，加入含10% (体积百分比)胎牛血清的DMEM培养液9. 9 mL,充分混勻， 0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌后100 PL分装，-20°c密封保存，使用时胚胎干细胞培养液稀释为所需浓度。6.碱性成纤维细胞生长因子的分装取一个包装的碱性成纤维细胞生长因子 (Invitrogen公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法，其特征在于分离 期胚盘明区的细胞，经机械吹打分散成单个细胞或小细胞团后，接种于ＳＴＯ饲养层，用上述鸡胚胎干细胞在专用培养基及３７～３８℃环境下培养，３～５天传代一次，专用培养基包括条件培养液６００—９００ｍＬ；胎牛血清５０—１５０ ｍＬ；鸡血清５—２０ ｍＬ；非必需氨基酸中的一种或几种混合物５—２５ ｍＬ；Ｌ－谷氨酰胺０．１４６—０．２９２ ｇ；β－巯基乙醇６—１４ μＬ；小鼠白血病抑制因子１—２×１０６ ＩＵ；碱性成纤维细胞生长因子１０—５０ μｇ；干细胞生长因子５—２０ μｇ，将上述成分用ＤＭＥＭ高糖培养基定容至１０００ ｍＬ，调ｐＨ值为７．２—７．５，条件培养液是这样获得的，培养ＢＲＬ－３Ａ细胞至细胞汇合后，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王丙云，陈胜锋，陈志胜，计慧琴，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：44
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