本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的将抗逆基因AtNDPK2导入转基因741杨的方法。本发明专利技术以转双抗虫基因741杨的叶片为外植体，将抗逆基因AtNDPK2通过农杆菌导入到转基因741杨中，并对最佳不定芽诱导培养基、继代培养基、最佳生根培养基，以及影响转化的几个因素，例如共培养时间、共培养培养基的pH、最佳潮霉素筛选浓度等进行了研究。本发明专利技术利用农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入到转基因741杨中，获得了再生植株。同时建立了高效快速的转基因741杨组培再生体系，转基因741杨叶片的不定芽转化频率可达40％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种农杆菌介导的将抗逆基因AtNDPK2导入转双抗虫基因741杨的方法。
技术介绍
随着植物转基因技术的日益成熟，越来越多的转基因植物研制成功并逐渐进入市场，我国在林木转基因方面也取得了一定的进展。转双抗虫基因741毛白杨(以下简称转基因741杨)是河北农业大学林学院生物技术实验室和中科院合作，运用农杆菌介导法将 Bt杀虫蛋白BtCrylAc基因和慈菇蛋白酶抑制基因AHPI双价抗虫基因同时转入优良741毛白杨，获得的不同系号转双抗虫基因无性系。室内饲虫试验已确定出高抗株系(室内试虫死亡率>75%)和中抗株系(室内试虫死亡率40% 75% )。转基因741杨的成功研制为害虫防治提供了一条新的途径。在已转入基因的物种中再转入具有其他的功能的新基因，目前还没有研究报道。 转基因741杨由中科院微生物所与河北农业大学合作完成。双抗虫基因的导入，使转基因 741杨获得了高抗杨扇舟蛾和美国白蛾等主要鳞翅目害虫的能力，大大减少农药施用量。 同时通过室内及试验地的饲虫试验，苗期的生长观测和形态观测以及分子生物学检测等方法，最终获得了基本不飞絮的败育雌株转双抗虫基因的优良白杨派杂种，避免了种间的花粉传播，降低了 741杨基因污染的风险。NDPK2基因主要编码植物核苷二磷酸激酶2，近年来的研究表明，NDPK2可参与促分裂原蛋白激酶MAI3K级联反应，进而上调P0D、CAT、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和过氧化物还原酶等多种抗氧化酶基因的表达，调节细胞的氧化还原状态M。从拟南芥中克隆出NDPK2基因，命名为AtNDH(2。AtNDPK2的对大麦、马铃薯的遗传转化研究也表明，AtNDPK2 基因的过量表达增强了作物对干旱、盐渍或极端温度的忍耐性。AtNDPK2基因对作物的遗传转化具有重要的实践意义。但迄今为止，未见有关此基因在杨树中遗传转化的报道。随着环境的不断恶化，植物不仅要受到病虫的危害，而且诸多非生物因素，如干旱、盐碱、低温也严重影响着植物的生长发育和作物产量。杨树是林业最早开展基因工程研究的树种，尤其是转抗逆基因的木本植物在治理盐碱化、沙漠化土地，改善生态环境及增加林业收入等方面，具有草本植物不可替代的优势。随着我国土地荒漠化、盐渍化和冻害的不断加剧，病虫害的不断增加，利用现代生物技术，快速培育兼有抗虫和抗逆植物新品系，是实现扩大种植面积，缓解土地矛盾，减少农药危害的有效途径之一。
技术实现思路
本文以已转入双抗虫基因的741毛白杨无菌苗的叶片为材料，建立其再生及转基因体系，并通过农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入其中，以期获得即抗虫且抗非生物胁迫能力强的转基因杨树新品系。本专利技术的技术依据是以转基因741杨的叶片为外植体，在已转入双抗虫基因的基础上，采用农杆菌介导的转化方法，将抗逆AtNDPK2基因导入转基因741杨中，获得了即抗虫、又抗逆的转基因杨树，通过对转化条件的优化，建立稳定的遗传转化体系。为杨树抗虫、抗逆品种的培育奠定基础，同时还可以为杨树基因工程操作技术提供参考数据。本专利技术涉及到的转双抗虫基因741毛白杨的无菌苗，由河北农业大学林学院提供；本专利技术涉及到的根癌农杆菌EHA105，其携带的质粒pCAMBIA1300上含有AtNDH(2 基因片段；此菌种由韩国生命工学研究院(KRIBB)提供。MS(Murashige and Skoog，1962)培养基，是植物组培的常用培养基，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。本专利技术所用的植物培养基均以MS为基本培养基，附加了不同的添加剂。本专利技术是通过如下步骤实现的I制备侵染菌液挑取农杆菌EHA105的菌落接种到含有潮霉素50mg/L的10 15ml YEP液体培养基中，于下，200rpm震荡培养对小时，取10 100 μ 1的菌液转接至30 50ml的YEP 液体培养基中，于下，200rpm震荡培养，待菌体OD6tltl达到0. 8 1. 0时，离心收集沉淀， 用与离心前等体积的MS液体培养基重新悬浮沉淀后，即得侵染菌液；II 转化a.预培养取转基因741杨无菌苗的叶片，在靠近叶柄1/3处沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养 2天；所述的分化培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉 6. 5g/ L；b.共培养将步骤IIa所得叶片完全浸没在步骤I制备的侵染菌液中10 20min， 用无菌滤纸吸干叶片后，转入共培养培养基上，25 27°C进行暗培养3 5天；所述的共培养培养基为MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 6. 5g/L ；c.筛选培养用无菌水冲洗共培养后的叶片，然后用无菌滤纸吸干，将叶块转移到分化筛选培养基上培养，培养温度为25 27°C，光照强度为25001UX，光照时间为14小时/天，培养2-3周分化出抗性不定芽；所述的分化筛选培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. Img/L+Hyg3mg/L+Cef400mg/ L+蔗糖30g/L+琼脂粉6. 5g/L ；d.继代筛选培养将步骤c所得抗性不定芽转到继代筛选培养基中进行培养20 30天获得抗性芽，每10天换一次培养基；培养温度为25 27°C，光照强度为 25001UX，光照时间为14小时/天；所述的继代筛选培养基为MS+6-BA0. 5mg/L+IBA 0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef 400mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L ；e.生根培养步骤d所得抗性芽长到2 3cm时，切下并插入生根筛选培养基上进行生根培养，培养2-3周，获得抗性植株；所述的生根筛选培养基为1/2MS+IBA0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef400mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L ；III 鉴定CTAB法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide)能够提取植物基因组DNA，属于一般分子生物学常规操作。采用CTAB法提取步骤 II所获的转基因植株的DNA，作为被检模板，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)法对候选植株进行鉴定，所用引物如下上游引物5‘ -ATTTATCGGCAAGGTGGAGGTT-3 ‘，下游引物5‘ -CCCGGTGAGGTGATTTGAA-3 ‘；PCR 反应条件-MV lmin，54°C lmin，72°C 2min，;35 个循环；72°C延伸 lOmin，扩增产物用0. 琼脂糖凝胶电泳检测。PCR又称为“多聚酶链式反应”，是本领域技术人员公知的实验方法，根据PCR引物以及PCR反应条件，本领域技术人员可依据常识确定PCR反应体系，扩增出目的基因。本专利技术通过上述操作，利用农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入到转基因741 杨中，获得了抗逆植株。在此过程中，通过对共培养条件的优化，我们发现1.当在共培养培养基中加入200 μ mol/L乙酰丁香酮，调节共培养培养基的pH为 5. 2时，共培养的效果较好；2.当上述共培养的条件本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种将抗逆基因导入转基因７４１杨的方法，其特征在于，具体步骤为：Ｉ制备侵染菌液挑取农杆菌ＥＨＡ１０５的菌落接种到含有潮霉素５０ｍｇ／Ｌ的１０～１５ｍｌ ＹＥＰ液体培养基中，于２６℃下，２００ｒｐｍ震荡培养２４小时，取１０～１００μｌ的菌液转接至３０～５０ｍｌ的ＹＥＰ液体培养基中，于２６℃下，２００ｒｐｍ震荡培养，待菌体ＯＤ６００达到０．８～１．０时，离心收集沉淀，用与离心前等体积的ＭＳ液体培养基重新悬浮沉淀后，即得侵染菌液；ＩＩ转化ａ．预培养：取转基因７４１杨无菌苗的叶片，在靠近叶柄１／３处沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪１个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养２天；所述的分化培养基为：ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ ０．１ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉６．５ｇ／Ｌ；ｂ．共培养：将步骤ＩＩａ所得叶片完全浸没在步骤Ｉ制备的侵染菌液中１０～２０ｍｉｎ，用无菌滤纸吸干叶片后，转入共培养培养基上，２５～２７℃进行暗培养３～５天；所述的共培养培养基为：ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ ０．１ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉６．５ｇ／Ｌ；ｃ．筛选培养：用无菌水冲洗共培养后的叶片，然后用无菌滤纸吸干，将叶块转移到分化筛选培养基上培养，培养温度为２５～２７℃，光照强度为２５００ｌｕｘ，光照时间为１４小时／天，培养２－３周分化出抗性不定芽；所述的分化筛选培养基为：ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ ０．１ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ３ｍｇ／Ｌ＋Ｃｅｆ４００ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉６．５ｇ／Ｌ；ｄ．继代筛选培养：将步骤ｃ所得抗性不定芽转到继代筛选培养基中进行培养２０～３０天获得抗性芽，每１０天换一次培养基；培养温度为２５～２７℃，光照强度为２５００ｌｕｘ，光照时间为１４小时／天；所述的继代筛选培养基为：ＭＳ＋６－ＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ５ｍｇ／Ｌ＋Ｃｅｆ ４００ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉６．５ｇ／Ｌ；ｅ．生根培养：步骤ｄ所得抗性芽长到２～３ｃｍ时，切下并插入生根筛选培养基上进行生根培养，培养２－３周，获得抗性植株；所述的生根筛选培养基为：１／２ＭＳ＋ＩＢＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ５ｍｇ／Ｌ＋Ｃｅｆ４００ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉６．５ｇ／Ｌ；ＩＩＩ鉴定采用ＣＴＡＢ法提取步骤ＩＩ所获的转化植株的ＤＮＡ，以ＰＣＲ法对候选植株ＤＮＡ进行检测，所用引物如下：上游引物：５′－ＡＴＴＴＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴ－３′，下游引物：５′－ＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＧＡＡ－３′；ＰＣＲ反应条件：９４℃１ｍｉｎ，５４℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，扩增产物用０．８ｗ％琼脂糖凝胶电泳检测。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金华，姜国斌，郭鹏，朱学静，王颖，
申请(专利权)人：大连民族学院，
类型：发明
国别省市：91
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