一种提高水稻穗转化法效率的培养基配方组成比例

本发明专利技术提供了一种提高水稻穗转化效率的培养基配方，具体地该培养基用于农杆菌用的悬浮，所述转化培养基含有细胞分裂素、silwetL-77、曲拉通X-100和赤霉素。该培养基将大大提高水稻穗法转化的效率，具有重要应用和推广价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物转基因工程领域，具体地是涉及提高水稻浸花转化效率的转化培养基配方。
技术介绍
水稻是我国第一大粮食作物，产量约占粮食总产量的40%。稻米是我国人民赖以生存的主食。确保水稻生产是保证我国粮食安全的基础，关系国计民生。培育高产、优质、高效的水稻新品种是稳定水稻产量、提高水稻品质的首要任务。传统的遗传育种技术为提高水稻的产量和改善质量做出了重大的贡献，但传统的杂交育种存在周期长、效率低和种间杂交困难等问题，加上水稻种质的匮乏和生态环境的恶化，给水稻的遗传改良带来了一定的困难。大大限制了水稻新品种的培育。随着分子生物的发展，转基因技术打破了物种隔离，为植物种质资源创新，定向选育优质高产高效的新品种提供了一个有效的操纵平台。目前，用于水稻转基因技术的方法主要有基因枪转化法和农杆菌介导的转化法。 基因枪转化方法是上个世纪80年代专利技术的一种转基因技术，其优点是不受物种限制、受体取材广泛(几乎所有具有潜在分化能力的原生质体、细胞、组织和器官都可以受体)、转化效率高；但是该方法也存在着基因插入不完整、高比例的不育、多拷贝频率高以及仪器设备费用高等缺点。农杆菌介导的水稻转化方法因谷物类作物不是农杆菌的天然宿主等原因而研究和开发的时间比较晚，但该方法具有转化频率高、多拷贝频率低、成本低、操作简便等优点而成为水稻转化最常用的转基因技术。现阶段，基因枪和农杆菌介导的水稻转化方法都需要经过植物的再生阶段，因此转化实验的成功很大程度上依赖高效高频的水稻再生体系的建立。水稻的再生体系受品种、基因型等条件的限制。目前，粳稻的再生体系已经比较成熟，农杆菌介导的粳稻转化效率也可以达到60%甚至更高，但是籼稻的最高转化效率只有 10%左右。而籼稻品种占整个水稻品种的80%，因此如何建立籼稻的高频再生体系从而提高其转基因效率一直是困扰生物学家的一个难题。许多生物学家围绕着此问题展开了一系列的研究，包括改变培养基的配方、调节转化时间、改变农杆菌的转化浓度等，但是取得的成就并不显著，籼稻的转化效率并没有明显的提高。有科学家从另一个角度入手，建立了农杆菌介导的水稻穗转化法，以水稻穗为转化受体，不需要漫长而复杂的水稻再生过程，避开了上述水稻再生体系建立的种种问题。本专利技术人经过长时间的摸索，得到了一种能够提高水稻穗转化效率的转化培养基配方，该培养基配方将将大大加快水稻穗转化法的应用和推广，具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种提高水稻穗转化效率的培养基配方，具体地该培养基用于农杆菌用的悬浮，所述转化培养基含有细胞分裂素、silwet L-77、曲拉通X-100和赤霉素。本专利技术所提供水稻穗转化的方法，所用的转化培养基添加了胞分裂素6-BA、silwet L-77、曲拉通X-100和赤霉素GA。其中，转化培养基中细胞分裂素6-BA的用量优选50 μ g/L ；silwet L-77的用量优选80 μ g/L ；曲拉通X-100的用量优选100 μ g/L ；赤霉素GA的用量优选5 μ g/L。本专利技术含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于=PBin系列载体、pBI系列在、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于AGL0、AGLU GV3101、EHA105、 LBA4404 等。本专利技术提供了一种提高水稻穗转化效率的培养基配方，该配方适用于籼稻或粳稻的野生或栽培品种、中间材料或育种材料。根据本专利技术的启示，显然，本领域的技术专家可以在本专利技术的基础上进行一些改进和修改，这些改进和修改也纳入本专利技术中。为了便于理解，下面将结合附图和实施例进一步诠释本专利技术。具体实例和附图仅是为了更好的阐述本专利技术，并不构成对本专利技术范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。附图说明图1载体KAT-Al示意图。 具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法，所用试剂购自上海生工生物工程有限公司，引物均由上海英骏生物技术有限公司合成，PCR试剂盒来自^witrogen 公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体、菌种属于本实验室。实施例1、水稻穗法转化籼稻明恢63获得转基因植株一、水稻穗法转化水稻植株1.实验材料农杆菌菌株农杆菌菌株为AglO，本实验室保存。含有质粒载体KAT-A1。质粒=KAT-Al含有来源于水母的红色荧光蛋白报告基因AsRed，带有hpt筛选标记基因，可抗潮霉素抗生素。KAT-Al载体为本实验室构建。(如附图1)供转化水稻品种明恢632.根癌农杆菌的培养挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB+Kana+Rif平板上画线，，黑暗培养2天。挑取单菌落接种于50ml抗性YEB液体培养基中，28°C，200rpm过夜培养。吸取上述培养物接种于IL YEB液体培养基中，150rpm摇过夜，直至0D600=2。将上述0D600=2 的农杆菌悬浮液在5000rpm离心lOmin，沉淀后的农杆菌，悬浮于转化培养基中，用于水稻转化。3.转化菌液准备配制转化用转化培养基。转化培养基组成成分MS培养基+ 6-BA 20 μ g/L + GA 5 μ g/L + As 20 mg/L + Silwet L — 77 50 μ 1/L + Triton X-100 200 μΙ/L，调节使 pH=5. 8将培养好的农杆菌用转化培养基重悬，稀释到0D600=1. 0左右备用。4.水稻穗选择准备选取大田中水稻穗型良好，水稻穗上大部分处于初花期，生长健壮的植株，作为待转化植株。对其进行编号、挂牌。5.农杆菌介导的水稻穗法转化1)将植株弯曲，使水稻穗完全浸于菌液中，浸染90sec左右。2)浸染过程结束，用硫酸钠纸袋将处理过的水稻穗套住，以保持一定的湿度。3)重复转化过程隔天重复一次。每次转化后都需要把水稻穗套袋，纸袋可于最后一次转化后的Mhr后去掉。7.收获转化后其他管理按照常规技术进行，直至种子成熟收获。将种子混收后(TO代种子)， 对Tl代进行筛选及其它检测。权利要求1.一种提高水稻穗转化效率的培养基配方，其特征在于该培养基含有细胞分裂素、 silwet L-77、曲拉通X-100和赤霉素。2.根据权利要求1所述的水稻转化方法，其特征在于所述转化培养基中细胞分裂素 6-BA的用量优选50yg/L。3.根据权利要求1所述的水稻转化方法，其特征在于所述转化培养基中silwetL-77 的用量优选80yg/L。4.根据权利要求1所述的水稻转化方法，其特征在于所述转化培养基中曲拉通X-100 的用量优选100yg/L。5.根据权利要求1所述的水稻转化方法，其特征在于所述转化培养基中赤霉素GA的用量优选5yg/L。全文摘要本专利技术提供了一种提高水稻穗转化效率的培养基配方，具体地该培养基用于农杆菌用的悬浮，所述转化培养基含有细胞分裂素、silwetL-77、曲拉通X-100和赤霉素。该培养基将大大提高水稻穗法转化的效率，具有重要应用和推广价值。文档编号C12N15/82GK102329815SQ201110100259公开日2012年1月25日 申本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种提高水稻穗转化效率的培养基配方，其特征在于该培养基含有细胞分裂素、ｓｉｌｗｅｔ　Ｌ－７７、曲拉通Ｘ－１００和赤霉素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：夏勉，张斌，张建新，
申请(专利权)人：北京未名凯拓作物设计中心有限公司，
类型：发明
国别省市：11