本发明专利技术公开了一种用于从生物材料中直接扩增DNA片段的方法及试剂盒。本发明专利技术的试剂盒包括：裂解液a：50-70v％PEG200、20-40mM?KOH，pH13.2-13.8；裂解液b：5wt％-10wt％?chelex-100；裂解液c：5wt％-10wt％?chelex-100，1wt％-2wt％?TritonX-100；中和液：pH6.8-7.5的190-210mmol/L?Tris-HCl缓冲液，还可进一步包含2×Taq?PCR混合液。本发明专利技术的试剂盒及方法适用于细菌、动物组织、植物组织、真菌、血液、唾液和毛发等多种样品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与基因工程领域。具体地，本专利技术涉及一种从微量生物样品中扩增目标基因组DNA片段的方法。进一步，本专利技术涉及基于本方法的试剂盒及其试剂组成和操作方法。
技术介绍
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子。随着分子生物技术的发展，基因组DNA抽提技术和PCR扩增技术已经成为分子生物学研究的基础，也是基因组DNA及其相关研究中最重要的一个环节。DNA存在于各种生物的细胞核、线粒体、叶绿体中，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。DNA作为重要的遗传物质基础具有三个重要特性(1)同一个体的一致性，也就是说同一生物体的各个部分体细胞的DNA组成是相似的。根据DNA这个特性，可对物种进行鉴定，如DNA条码技术。DNA条码是一段能够高效鉴定物种的DNA标准区域，通过此项新技术可以准确快速的鉴定新物种。( 不同个体之间高度的特异性，每个个体的DNA 都不会完全相同；根据这一特性可以进行法医个体识别，如DNA指纹识别。DNA指纹是指个体间特异的DNA多态性，其个体识别能力类似于手指指纹识别，每个个体之间都是高度特异的。可用来进行个人识别鉴定。(3)DNA的恒定性，DNA作为一种稳定的遗传物质，在生物体中具有稳定性，不受年龄和营养条件等因素的影响。虽然DNA十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种隐定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，从而会产生一种新的性状，也可能引起某种病变。根据这一特性可以通过检测DNA来预测或诊断疾病。以上所述DNA应用通常都涉及以下几步第一，样品采集；第二，设计合成相应的引物；第三，PCR扩增；第四，筛选和比对。其中就应用到了基因组DNA抽提和目的片段PCR 扩增这两项最基本也是最重要的分子生物学实验技术。常规的DNA抽提方法通常包含三个步骤，第一步是样品裂解，通过一些离液剂(异硫氰酸胍、盐酸胍)或是离子去污剂(SDS、 CTAB)将细胞裂解，使DNA游离出来，分布在混合液中。第二步是DNA纯化，借助有机溶剂或是吸附柱将蛋白、酚类物质和糖类物质等杂质与基因组DNA分离。第三步为DNA的沉淀富集，通过乙醇或异丙醇使DNA聚集，再过水或是TE (IOmM Tris-HCl，ImM EDTA, pH8. 0)进行溶解或洗脱。由于各种分子生物研究的方式和目的不同，所以对基因组的质量要求也不同。对于一些微量样品，尤其是一些比较珍贵的样品，如果用常规方法进行DNA抽提，少量的DNA会在一步一步的操作过程中损失，最后就很难得到用于下一步实验的DNA。所以针对不同的研究要求，选择最合适的实验方法可使研究工作者在最短的时间内获得最真实最理想的结果。目前国内外市场上开发出了多种商品化的DNA抽提纯化试剂盒。根据纯化方法可以分为以下几种(1)有机溶剂纯化方法，这是最经典的一种核酸抽提纯化的技术；(2)盐析纯化法，是一种经济且毒性较小的种核酸抽提纯化方法。( 玻璃珠纯化法，是早期核酸抽提试剂盒中常用的一种方法，不过由于存在玻璃珠残留等问题，已经逐渐被其他方法所取代。(4)吸附柱纯化法，是利用一种特殊的玻璃纤维膜对核酸进行吸附的方法，操作简单适合高通量核酸抽提。( 磁珠纯化法，是利用纳米级磁性微粒与核酸发生吸附反应，磁珠可在磁场的作用下发生聚集和分散，使核酸的分离纯化实现自动化的一种方法。(6)离子交换介质纯化方法，采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下，使DNA能在离心过柱的瞬间结合到DNA纯化柱上，获得的核酸纯度较高。以上几种商品化的DNA抽提纯化试剂盒都有各自的优势，不过，获得质量较高的基因组DNA的前提是需要一定起始量的样品。如果样品量非常少，如小米粒大小的动物组织，就不适合选用以上的抽提方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种快速而简便的方法及试剂盒，从来源不同的微量样品中快速提取基因组DNA，用于PCR扩增或以PCR扩增为基础的相关检测。本专利技术首先提供了一种生物样本DNA抽提用试剂盒，包括1.裂解液 a 裂解液a为含有下列溶质的水溶液50-70% PEG200 (v/v)、20_40mM KOH,裂解液酸碱度为pH13. 2-13. 8，优选 pH 13.5-13.8。优选的，裂解液a 含 60% PEG200、20mM KOH, ρΗ13· 5。2.裂解液 b:裂解液b为含有下列溶质的水溶液5% -10% chelex-100(wt% )。优选的，裂解液b 含 10% chelex-100。3.裂解液 c:裂解液c为含有下列溶质的水溶液5% -10% chelex-100,1-2%TritonX-100 (wt % )。优选的，裂解液c 含 10% chelex-100, lwt% ~2wt% TritonX-100。4.中和液为 pH6. 8-7. 5 的 190-210mmol/L Tris-HCl 缓冲液。较佳的，为 pH6. 8-7. 5 的 200mmol/L Tris-HCl 缓冲液。进一步的，chelex-100购自 Bio-Rad 公司。进一步的，所述试剂盒中还包括2 X Taq PCR混合液。所述2 X Taq PCR 混合液的配方为2 X PCR Buffer ；3_5mM MgSO4 ；0. 1-0. 2mM dNTP ；0.1-0.25U/μ L Taq DNA polymerase ；2XLoading Buffer。其中，PCRBuffer、Loading Buffer 均为常规。本专利技术的试剂盒可用于从样品中提取DNA或用于扩增样本DNA片段。本专利技术进一步提供了一种利用前述试剂盒从生物样品中提取DNA的方法，包括下列步骤1.选择前述试剂盒中合适的裂解液与样本混合裂解样本；2.将步骤1获得的混合液直接去除细胞碎片获得样本DNA。进一步的，步骤1中当所述生物样本选自动物组织、植物组织、细菌和酵母时，选用裂解液a。该裂解液的裂解条件为将样本与裂解液混合均勻后，在65°C下，裂解5-20分钟。当所述生物样本选自抗凝血液、血斑、凝固血块、细胞和口腔拭子时，选用裂解液 b。该裂解液的裂解条件为将样本与裂解液混合均勻后，在56°C下，裂解30分钟，100°C煮沸8分钟。当所述生物样本选自带毛囊的发根时，选用裂解液c和蛋白酶K(ProteinaseK)15 该裂解液的裂解条件为将样本与裂解液和蛋白酶K混合均勻后，在56°C下，裂解30分钟， 100°C煮沸8分钟，裂解液和!Proteinase K的混合体积比一般为8-12 1。步骤1中，样本与裂解液的混合比例为样本体积裂解液体积=0. 05-0. 1 1。当步骤1选用裂解液a时，在步骤1将样本裂解后步骤2去除细胞碎片前还包括将样本裂解后的混合液直接采用所述试剂盒中的中和液中和。进一步的，样本裂解后的混合液与中和液的混合比例为样本裂解后的混合液体积中和液体积=1 1。中和条件可为将样本裂解后的混合液与中和液混合均勻后，在室温下，中和1-2 分钟。步骤2中，去除细胞碎片可采用常规方法如离心等方法去除。采用本专利技术试剂盒所获得的样本DNA可直接用于PCR扩增。对与含有2XTaq PCR混合液本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种生物样本ＤＮＡ抽提用试剂盒，包括：１）裂解液ａ：裂解液ａ为含有下列溶质的水溶液：５０－７０ｖ％ＰＥＧ２００、２０－４０ｍＭ ＫＯＨ，裂解液酸碱度为ｐＨ１３．２－１３．８；２）裂解液ｂ：裂解液ｂ为含有下列溶质的水溶液：５ｗｔ％－１０ｗｔ％ ｃｈｅｌｅｘ－１００；３）裂解液ｃ：裂解液ｃ为含有下列溶质的水溶液：５ｗｔ％－１０ｗｔ％ ｃｈｅｌｅｘ－１００，１ｗｔ％－２ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；４）中和液：为ｐＨ６．８－７．５的１９０－２１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：芦丽亚，张丽娟，李威，
申请(专利权)人：生工生物工程上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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